水稻条纹叶枯病由灰飞虱传播的发生严重的水稻病毒病。该病2004年在浙江长兴突然发生，全县发病面积为663.3hm2，发病较重的田块丛病率达50%以上，株病率达17.6%，一般丛病率在10%左右，株病率在1%～5%，其中产量损失10%～30%为21.7hm2，损失30%以上为2.79hm2，涉及15个乡镇，个别严重田块颗粒无收。2005年水稻条纹叶枯病以较快的速度蔓延，6月中旬在长兴夹浦、洪桥、虹星桥、雉城等乡镇的单晚秧田和早播直播稻相继发病，部分严重田块株病率超过25%，7月10日左右，出现第二个症状表现高峰，移（抛）栽稻、直播稻不同程度发病，发病面积达1万hm2，其中66.67hm2损失产量20%以上。针对水稻条纹叶枯病流行的严峻形势，为了有效地控制病害暴发流行，确保水稻生产安全，从2005年起，我们对水稻条纹叶枯病及传毒媒介灰飞虱发生动态进行较为系统的监测，开展了防治技术的研究。现将调查试验结果综述如下：在前一年发病较重的田畈，选取有代表性的田块对水稻条纹叶枯的发生情况进行定期跟踪调查，以观察水稻条纹叶枯病的田间消长规律。从田间调查来看，秧田从6月上旬后期开始发病，6月15日出现第一个症状表现高峰；移栽到大田后，6月23日调查，丛病率为6%，株病率为0.89%，病情指数为0.08，至7月10日左右出现第二个症状表现高峰；以后随着发病株的枯死和分蘖的增加，丛病率和株病率都呈下降趋势，株病率下降相对较快，8月20日左右出现第3个症状表现小高峰（见图1、图2）。从田间发病调查情况看，发病程度最重在7月底，见图3。图1 水稻条纹叶枯病丛发病率增长动态（浙江长兴）图2 水稻条纹叶枯病株病发病率增长动态（浙江长兴）图3 水稻条纹叶枯病病情指数增长动态（浙江长兴）2005年灯下监测，5月中旬成虫开始上升，6月中旬出现了第2代成虫高峰，诱虫量大，诱虫量为2936头，7、8月出现了3、4代成虫的小高峰，9月出现了5代成虫高峰，9月中旬和下旬分别诱到成虫1522头和1722头，10月还有大量的成虫出现，见图4。图4 灯下灰飞虱成虫消长情况（浙江长兴，2005）2006年灯下监测，5月上旬灯下始见，下旬成虫开始上升，迁入水稻秧田为害，6月上旬后期至中旬出现了第2代成虫高峰，为全年虫量最高，诱虫达6337头，7月上旬、8月上旬又出现了3、4代成虫的小高峰，8月底至9月初后灯下虫量上升，出现了5代成虫高峰，诱到成虫1520头；10月灯下诱虫量减少，见图5。图5 灯下灰飞虱成虫消长情况（浙江长兴，2006）2005年4月22日麦田调查，越冬代虫量为5.4万头/hm2，6月16日秧田虫量为13.05万头/hm2，6月21日平均卵量480万粒/hm2，6月28日秧田虫量为4.05万头/hm2，7月下旬虫量为1.05万头/hm2，8月上中旬虫量为0.45万头/hm2，9月上旬虫量为1.5万头/hm2，9月15日虫量为4.05万头/hm2，9月20日虫量为7.5万头/hm2，9月26日虫量为16.5万头/hm2，9月30日虫量为25.5万头/hm2，10月5日虫量为33万头/hm2，10月10日虫量为27万头/hm2，10月15日虫量为10.95万头/hm2。2006年4月上旬麦田调查，越冬代虫量为15.9万头/hm2，6月30日秧田虫量为16.95万头/hm2，7月3日秧田虫量为8.55万头/hm2，7月中下旬田间虫量下降，8月1日虫量为8.55万头/hm2，8月14日虫量为19.95万头/hm2，8月25日虫量为17.25万头/hm2，8月28日虫量为20.1万头/hm2，9月8日虫量为24万头/hm2，9月下旬虫量上升，9月25日为153.45万头/hm2，9月29日虫量为28.55万头/hm2，10月虫量还比较高，10月8日虫量为48万头/hm2，10月12日虫量为31.5万头/hm2，10月17日虫量为30万头/hm2。田间灰飞虱消长曲线见图6。图6 田间灰飞虱发生消长情况（浙江长兴，2006）灰飞虱的发生量和带毒率对水稻条纹叶枯病的发生有着密切的关系，近年来，随着灰飞虱发生量增加和带毒率的提高，水稻条纹叶枯病发生面积扩大，发生程度加重。据测定，2005年长兴县灰飞虱带毒率斑点免疫快速测定为11.27%，2007年达18%。水稻灰飞虱生物法测定传毒率，2006年为6.7%，2007年为7.4%。田间观察，5月中下旬的1代灰飞虱成虫传毒造成秧田和部分早播直播田（5月下旬播种）发病，至6月中旬左右出现了水稻条纹叶枯病的第一个显症高峰；6月上旬后期至中旬的2代灰飞虱成虫高峰造成了7月中旬左右的水稻条纹叶枯病的第2个显症高峰，由于6月上旬后期至中旬的灰飞虱成虫高峰量较大，因此，7月10日左右水稻条纹叶枯病表现高峰来势凶猛，发病面积大，发病程度重；8月中旬在病情发展上有一个小高峰，如2006年8月7日左右个别失治田块出现了第3个症状表现高峰，株病率达20%以上。以后随着水稻的生长，抗逆能力增强，田间虽有大量的灰飞虱成若虫，但基本不发病。水稻条纹叶枯病的防治应立足于预防，采取“抗、避、断、治”的综合防治措施。在目前水稻对条纹叶枯病防治还没有高抗品种的情况下，重点要切断灰飞虱的传毒途径。为此，我们围绕灰飞虱的防治开展一系列的农业防治措施和药剂防治试验，根据水稻条纹叶枯病的感病期，强化药剂浸种、拌种处理和秧苗期、大田前期灰飞虱的防治，配合使用病毒钝化剂，水稻条纹叶枯病得到了有效地控制。在条纹叶枯病重发区，推广秀水63、秀水09等抗病性好的品种，压缩武运粳7号、加育991等感病品种种植。浙江长兴1代灰飞虱成虫迁移高峰期在5月中下旬，推迟至6月上旬播种的直播稻可避开大部分1代灰飞虱的迁入传毒，减少发病机率。水稻条纹叶枯病的感病期主要在秧苗期，水稻秧田期的灰飞虱防治尤其重要。因此，要及时清除农田周边杂草，5月上旬前冬闲田提前翻耕，减少灰飞虱中间寄主，恶化灰飞虱生存环境，抓好麦田灰飞虱的防治，麦田收割后及时灌水翻耕，并抓好“四边”杂草中灰飞虱的防治。同时抓好药剂浸种、拌种处理的秧田期和大田前期的灰飞虱防治。坚持“治杂草和麦田保秧田、治秧田保大田、治大田前期保大田后期”的策略。经过几年来的试验示范，防治灰飞虱以5%锐劲特45～50ml/667m2、40%毒死蜱100～120ml/667m2、50%稻丰散100ml/667m2，加水50kg喷雾防治为佳。在浸种灵浸种的基础上，催芽露白后每千克种子用35%丁硫克百威（稻拌成、稻伴）种子处理干粉剂5g拌种，混拌均匀后播种，随拌随用。在水稻发病前和发病初期，配合使用病毒钝化剂2%菌克毒克100～150ml/667m2防治1～2次，减轻水稻发病程度，减少水稻产量损失。

豆瓣菜（Nasturtium officinale R.Br.）又名西洋菜、水蔊菜、水田芥，属十字花科豆瓣菜属植物。枝叶柔嫩青翠，性喜冷凉，较耐霜冻，是深受人们喜爱的冬春上市的水生绿叶蔬菜。有关豆瓣菜菌核病国内尚未有专门报道。该病1999年在武汉旱地栽种的豆瓣菜田中仅见零星发生，到2001年春发病田中的发病面积可达1.61%，甚至到10%左右，表明病害有增重的趋势。豆瓣菜的茎、叶、叶柄均可受害。以中、下部贴近地面匍匐或半匍匐生长的枝叶受害最重。田间病害呈点片状发生，不规则分布。因豆瓣菜分枝多，生长繁茂，茎呈匍匐或半匍匐丛生，故发病初期常需拨开丛生状植株，才能发现感病枝叶，后期因植株枯死而呈现近圆形至不规则形病区。茎部受害，水渍状，淡褐色，边缘不清晰，从病处向两端扩展，空气湿度大时生茂密的绵毛状白霉，继而在植株表面及病茎的空腔中菌丝集结成近球形、扁球形、鼠粪状或不规则的菌核。菌核初白色，成熟后黑色，内部白色。罹病植株病部软腐，但无恶臭，最后失水干枯而呈枯草黄色。叶柄症状与茎部同。病叶受侵处灰褐色或浅黄褐色，湿度大时亦生较稀疏的绵毛状白霉，最后病叶腐烂或干枯。该病一般在12月上中旬出现病株，1月下旬至2月上中旬是大棚中豆瓣菜菌核病的盛发期，大棚和露地均在3月上旬病情趋于稳定。在近几年的调查观察中，一直未见浅水栽植的豆瓣菜有菌核病发生，而旱地栽植的豆瓣菜，不论大棚或露地种植的条件下均可受害，并且大棚中的病情有较露地重的趋势。病茎失水干枯后，菌核极易脱落，而病茎空腔内的菌核则随病株残体遗留在土中。该病的初侵染，来自遗留在土中的菌核产生的子囊孢子。子囊孢子不能侵染健壮的枝叶，而极易侵染中下部贴近地面匍匐或半匍匐生长的衰老叶片，此后才能侵染健壮的枝叶。再侵染主要通过病患组织接触，由病部长出的绵毛状菌丝体完成。豆瓣菜的匍匐或半匍匐生长及分枝多、生长繁茂、枝叶交错的植物学性状和病原菌侵染循环特点，决定了其有利于菌核病菌的接触蔓延，而不利于子囊孢子的气流较远距离的传播，因而造成了植株中、下部枝叶发病的现象，这样就使豆瓣菜菌核病具有一定的“隐蔽性”，也导致田间病害呈点片状发生及不规则分布的特点。菌丝管状、无色，有分枝具隔膜，田间自然情况下菌丝体白色绵毛状，在病茎表面及被害茎的空腔里均可形成菌核。在测量的87个菌核中，其大小（长径）为2.0～7.0mm。菌核无休眠期。将菌核置培养皿中双层浸湿的滤纸上，13.5～16.0℃，室内散射光下培养很易萌发。一个菌核可生出一至数个子囊盘，子囊盘高足杯状，初淡褐色，后为暗褐色。柄长短因环境而异，在黑暗无光条件下，柄长可达6.0 cm以上。子囊盘中生有大量子囊和侧丝，子囊无色棒状，内生8个排列一行的子囊孢子。子囊孢子椭圆形，无色单胞，大小8.7～13.7μm×4.9～8.1μm。子囊孢子成熟后稍受震动（如打开供菌核萌发的培养皿的盖），即可看到状如烟雾的子囊孢子放射现象。据上鉴定，认为豆瓣菜菌核的分离物为Sclerotonia sclerotiorum（Lib.）de Bary。这是我们首次在豆瓣菜上发现有由核盘菌引起的菌核病。进一步研究发现该菌菌丝生长温度范围很广，其中在4～5℃时，菌落在PDA平皿上扩展速度为8.3mm/天、33℃时为2.0 mm/天、当温度达到35℃时，菌落几乎停止生长。病菌菌丝生长最适温度是21℃，在此温度下，菌落扩展速度达32.2 mm/天。

核盘菌是普遍存在的坏死性真菌病原，能够侵染75科408种植物。在寄主植物中尚未发现免疫种或单基因抗性，包括十字花科。然而在禾本科等非寄主植物中该病菌是不致病的或弱致病的。为研究非寄主抗性机制，我们用该病菌接种了竹子、小麦、玉米和油菜。接种后24 h，这些植物对病菌的反应是不同的，竹子和玉米上无病斑，小麦上有小的病斑，但不同品种有变化，而油菜上产生了大的病斑。扫描电子显微镜研究表明，接种的竹子叶表面形成了一层膜，但在光学镜下菌丝穿透进入了上表皮细胞。菌丝进入竹子和油菜叶表皮细胞的方式是不同的。在油菜上菌丝很快进入上表皮细胞和细胞间隙，但竹子中菌丝仅限于上表皮和叶肉细胞。我们推定禾本科植物叶表面物质和细胞壁成分可能是阻止菌丝进入细胞的重要障碍。需要进一步分析这些成分。Sclerotinia sclerotiorium(Lib.)de Bary is a ubiquitous necrotrophic fungal pathogen capable of infecting at least 408 plant species of 75 families.No highly resistant varieties or germplasm is found in hosts including Cruciferae plants.On non-host plants such as some Gramineae species,however,the pathogen is avirulent or weak virulent.To understand how these non-hosts resist the pathogen,we inoculated S.sclerotinia mycelium to the leaves of bamboo,wheat,maize and oilseed rape as well.There were different responses in these plants after 24 hpi(hours post inoculation).No lesion was found on bamboo and maize leaves.Small lesions were observed on wheat,but the lesion size varied among different cultivars.Larger lesions were observed on oilseed rape leaves than any other Gramineaes at earlier time after inoculation.The scanning electron microscope(SEM)study showed clearly that inoculated bamboo leaf formed a layer of membrane on the leaf surface,but the slides under a light microscope unveiled hyphae penetration into the epidermal cells.The modes that hyphae grew into the leaves were also different between bamboo and oilseed rape.The hyphal growthfast under the oilseed rape epidermal and in the intercellular space,but in bamboo the growth was limited in the epidermis and mesophyll cells.We assumed that surface substance and cell wall composition are important obstacles of the hyphal penetration in non-host Gramineae plants.Further work needs to be done to analyze these compounds in comparison with oilseed rape.

正向（经典）遗传学是通过生物的表型来推测其遗传物质的组成、分布和传递规律等，而反向遗传学是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论和技术，通过核苷酸序列的定点突变、缺失和插入等创造突变体并研究突变所造成的表型效应。随着基因组测序技术、侵染性克隆的构建技术、定点突变技术和报告基因的使用等，反向遗传学技术在研究植物病毒基因功能、侵染过程和致病机理等方面的应用越来越广泛。本文报道了该技术在研究马铃薯Y病毒（PVY）HC-Pro和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）P22功能方面的部分结果。PVY HC-Pro基因由本实验室提供，SPCSV的有关基因由芬兰赫尔辛基大学Valkonen教授提供，PVX201质粒由Baulcombe教授提供。突变试剂盒（Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）购自STRATAGENE公司，大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存，PCR突变引物由赛百盛公司合成。Figure 1 Symptoms of Nicotiana benthamiana plants inoculated with different constructs based on PVX 201将SPCSV P22、P28和RNaseIII等基因克隆到PVX201载体上，根据接种后出现的症状判断哪个基因能增强PVX对本氏烟的致病力。将PVY HC-Pro克隆到PVX201载体上，针对HC-Pro的KITC和IGN等位点设计合适的突变引物，参考突变试剂盒（Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）说明进行突变。通过测序证实所得突变体的准确性。大量提取法提取质粒PVX201、PVXHC或相应的突变体，摩擦法接种本氏烟（Nicotiana benthamiana），观察所致症状的差别。PVX201载体在本氏烟上引起轻微的斑驳和褪绿花叶症状，但不引起植株的死亡。SPCSV P28和RNase III等基因连接到PVX201后对症状无影响，但P22能提高PVX对本氏烟的致病力，导致了接种植株的死亡，说明P22是致病性的增强子。携带P22的PVX（PVX-p22）首先在接种叶上引起坏死斑点。坏死斑点扩展后，沿着叶脉到达茎部，引起上部组织坏死，最终导致本氏烟整株枯死。RNA沉默抑制因子HC-Pro也能提高PVX对本氏烟的致病力。表达HC-Pro的PVX（PVX-HC）在接种后7天出现严重明脉和卷曲，10～14天时首先心叶出现坏死，随后整株萎蔫死亡。但在接种叶上没有坏死斑，看不到明显的扩展迹象。KITC是HC-Pro的一个重要基序，参与病毒的蚜虫传毒、协生和抑制RNA沉默等过程。我们在测定烟草脉带花叶病毒（TVBMV）全基因组序列时发现，TVBMV（YND分离物）HC-Pro KITC基序中的K变成了R，而且也有蚜虫传毒活性。我们把PVY HC-Pro的KITC突变成RITC后，再接种本氏烟，发现该突变仍能引起本氏烟植株的死亡。把K突变为A（突变体1，K52A）后，突变体也能引起本氏烟死亡，说明HC-Pro KITC基序中的K可能不参与和PVX的协生。但把KITC基序中的C缺失后（突变体2，C55Del）就不能引起植株死亡，说明KITC基序中的C对于协生作用是不可缺少的。对于HC-Pro其他突变体的功能分析正在进行中。

洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。1949年美国植物病理学家Burkholder首次发现B.cepacia可以引起洋葱酸皮病[1]。随后在20世纪50年代人们从第一例由B.cepacia引起的心内膜炎开始，发现该菌广泛存在于医院，并且可以使人类患上多种疾病，尤其是囊性肺纤维化（Cystic fibrosis，简称CF）病人的易感细菌之一，严重的会因此患“洋葱伯克霍尔德菌综合症”致死。最近研究表明，该菌致人死亡的一个原因要归咎于它含有脂多糖（Lipopolysaccharide）分子[2]。在进行医学研究的同时，发现该菌在工业和农业上有生物降解、生物防治等功效，对农业生产和环境保护起着重要的作用，具有广泛的应用前景。近年来，随着细菌分类技术的发展，洋葱伯克霍尔德菌已不仅只是作为一个种，而是一组基因型不同、表型相近的复合物，称为洋葱伯克霍尔德菌复合型（Burkholderia cepacia complex，简称Bcc）[3]。本文将在农业、分类地位等方面对Bcc的研究进展做一综述，以达到全面了解该菌的目的。人类第一次发现伯克霍尔德菌是由于它导致了洋葱酸皮病，该病菌主要分布在土壤和灌溉水中，在洋葱鳞茎形成后，从其因收割等原因造成的伤口侵入，或者是黏在叶部的菌被水冲刷进入组织内引起鳞茎腐烂。Ulrich在1975年研究表明[1]，该病原菌在低pH值环境下可以产生一种内多聚半乳糖醛酸酶，使洋葱组织软化，利于病原菌的入侵和扩展。后来郭道森等人研究表明，该菌与松材线虫共同侵染黑松和马尾松，导致松林大面积死亡[4]，在后续的研究中发现，松材线虫的分泌物及死虫体均可促进该菌株的生长繁殖和致病作用，且活线虫的促进作用比死虫体更加显著，这可能是由于松材线虫提供给该菌株某些重要的营养物质[5]。2005年，意大利西西里东部地区种植的天堂鸟（Strelitzia reginae Aiton）幼苗（苗龄2～3个月）发生新病害，鉴定发现致病菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli），这是关于该菌导致天堂鸟叶斑病及枯萎病的首次报道。在植物体上广泛存在着一些细菌，它们都具有诱发植物体内水分结冰的作用，称为冰核细菌。在没有冰核细菌存在的植物能耐-7～-8℃的低温而不发生霜冻，但是在一些B.cepacia 细菌存在的情况下，同样条件的植物在-2～-3℃可诱发多种植物细胞水结冰而发生霜冻。张耀东等从菠菜上分离到一株具有冰核活性的Bcc菌株[6]。1.3.1 对有毒物质的降解 一些工业排放物中含有大量的有害芳香烃类物质，随着工业化进程的加快，残留于自然环境中的芳香烃类物质含量急剧增加，如何解决这类物质造成的危害，成为研究者要解决的问题，而利用微生物降解是消除其危害的重要途径之一。洋葱伯克霍尔德菌可以利用多种物质为唯一碳源，这意味着其能够以土壤和地下水污染的有毒且难降解的物质（邻苯二甲酸盐、除草剂和氯代烃类化合物等）为碳源并将其降解[7]。例如，Bcc的一个菌株G4可通过由苯酚诱导的芳香族途径将三氯乙烯降解，由于苯酚是环境优先污染物之一，因而不宜被推广使用；但该菌株的突变体G45223 PR1可以不利用任何诱导物而直接降解三氯乙烯[8]。另外，许多芳香烃化合物在降解过程中都会形成中间产物邻苯二酚，细菌可以通过邻位裂解和间位裂解两种途径继续降解邻苯二酚[9]。刘涛等[10]从炼油厂废水中分离筛选到一株苯酚高效降解的洋葱伯克霍尔德菌L68，该菌株可产生邻苯二酚2，3-双加氧酶[11]，而邻苯二酚2，3-双加氧酶是降解芳香族化合物的关键酶，在间位降解途径中，该酶可以催化邻苯二酚的苯环裂解，转化为2-羟黏糠酸半醛。因此，洋葱伯克霍尔德菌对消除芳香烃类化合物的污染具有重要作用。另外，洋葱伯克霍尔德菌对化学农药也有很强的降解作用。如，Sarfraz Hussain 等人研究发现，在pH值为8.0，温度为30℃时，该菌对α-硫丹和β-硫丹的降解率达90%以上，从而减少了杀虫剂硫丹（Endosulfan）对土壤和地下水的污染[12]。1.3.2 对油脂的降解 洋葱伯克霍尔德菌降解油脂的特性在国外已有研究，Pooja Rathi，Hustavova等人报道了该菌产脂肪酶应用于催化酯化水解反应等研究[13]，洋葱伯克霍尔德菌能在降解利用油脂的同时还分泌出一定量的胞外脂肪酶，同时通过所产生的脂肪酶等降解酶系作用于油脂，将其分解氧化为低级脂肪酸、甘油、醇类等低分子有机物，最后降解为H2O、CO2等代谢产物[14]。徐保成[15]等人对该菌所需的降解工艺条件进行优化研究，结果表明在优化的油脂降解条件下（pH值7.0，30℃，溶解氧3.0mg/L），处理初始油脂浓度1000mg/L废水，24h后其油脂降解率达到90%以上，COD（Chemical Oxygen Demand）去除达到92%。B.cepacia产生的脂酶可以催化拆分外消旋化学农药，使其变为光学活性农药，从而成倍地提高了药效，而且减轻了生物体内的积累与毒副作用，避免了不必要的环境污染[16]。洋葱伯克霍尔德菌可以防治多种植物病害，如从樱桃果实表面和伤口上分离获得的洋葱伯克霍尔德菌对甜樱桃褐腐病表现出显著的抑制效果[17]；郑维等从堆肥样本中分离的洋葱伯克霍尔德菌株CF-66具有广谱抗菌活性，并初步鉴定该菌属于洋葱伯克霍尔德菌基因型Ⅴ[18]；李纪顺等对伯克霍尔德菌B418进行了研究，表明该菌对小麦纹枯病、小麦全蚀病和番茄南方根结线虫病有很好的防治效果[19]。陈京元等从湿地松苗根际分离得到1株B.cepacia C23菌株，对引起湿地松猝倒病的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、链格孢菌（Alternaria alternata）有明显的抑制效果。洋葱伯克霍尔德菌的防病机制主要为其能产生多种具有抗菌活性的代谢产物，如铁载体（Pyochenlin、Pyoverdine）、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、Cepaciamide A（B）、Cepacidine A（B）、Cepacin A（B）；菌株H111 能够有效杀死线虫Caenorhabditis elegans，其作用机理主要是由该细菌产生的细胞外毒素所致死[20]。B.cepacia AMMDR1可以抑制由瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）和根腐丝囊菌（Aphanomyces euteiches）引起的豌豆和甜玉米苗猝倒病，作用机理主要是该菌抑制游动芽孢的裂解，阻止孢囊的萌发而影响病原菌的生长[21]。在不断的研究中发现，该菌可以与杀菌剂共同使用，如I.Omar等人发现，在对大豆根腐霉病菌（Fusarium oxysporum）引起的番茄冠根腐病的研究中，B.cepacia菌株C91与低浓度杀菌剂混合使用，相比单独使用高浓度杀菌剂，杀菌效果提高了20%[22]。这不但减少了杀菌剂的使用，同时减少了杀菌剂对环境的污染。美国环保署（EPA）已经批准了两种以洋葱伯克霍尔德菌为主要成分的生防菌剂的生产，其商品名为Deny和Intercept，Deny用于防止Rhizoctonia spp.、Pythium spp.、Fusarium spp.和线虫引起的病害，而Intercept则用于防治Rhizoctonia solani、Fusarium spp.、Pythium spp.引起的病害[23]。具有拮抗作用的细菌往往与植物的生长有很大的关系，这些细菌都可产生一些抑制真菌生长的物质，如：铁载体（Siderophores），细胞溶酶的分泌物，抗生素等。对真菌生长的抑制就可以直接促使植物生长[24]。B.cepacia可以产生铁载体，一方面根际促生菌铁载体的产生很快耗尽了病原菌生存所需要的铁，从而使病原菌的繁衍和侵染能力大大下降；另一方面根际促生菌通过铁载体向植物提供铁营养，从而使植物获益[25]；另外，B.cepacia还可以产生抗生素有效地抑制周围其他微生物的繁衍。同时，B.cepacia的一些菌株具有固氮和产生吲哚乙酸（IAA）的作用，有助于植物对营养物质的吸收[26]。Bcc菌株具有较强的溶解磷酸盐的能力，推动植物对释放的磷的吸收，促进植物生长，Babu-Khan等克隆到其溶解磷酸盐的基因[27]。另一方面其通过对病原微生物的生物防治，减轻或抑制有害的根围微生物，从而间接的促进植物生长。例如，玉米种子被Bcc菌株MCI7包衣后，其植株感染病原镰刀菌的几率大大降低，且植株鲜重和株高均显著增加[28]。B.cepacia 原名Pseudomonas cepacia，1950 年首次被Burkholder报道可引起洋葱酸皮病[29]。该菌的其他名字还包括eugonic oxidizers group 1，Pseudomonas kingii和Pseudomonasmultivorans[30]，但是相关研究明确指出这些命名是P.cepacia的同义词，而且P.cepacia具有命名的优先权[31]。因此，这些命名没有被写入细菌手册，直到1981年，Palleroni 和Holmes才重新找到依据区分这些命名的不同[32]。1992年Yabuuchi 等正式将该菌及其他6个属于rRNAⅡ群的假单胞菌（P.solanacearum，P.pickettii，P.gladioli，P.mallei，P.pseudomallei 和P.caryophylli）归为一个新属，即伯克霍尔德菌属（Burkholderia）。与Pseudomonas属不同的是，该属被归为变形菌门（Proteobacteria）[33]。当Burkholderia属的分类地位被确定以后，该属已包括超过30个不同的种：B.cepacia（典型种），B.caryophylli，B.mallei，B.pseudomallei，B.gladioli，B.plantarii，B.glumae，B.vietnamiensis，B.andropogonis，B.multivorans，B.glathei，B.pyrrocinia，B.thailandensis，B.graminis，B.phenazinium，B.caribensis，B.kururiensis，B.ubonensis，B.caledonica，B.fungorum，B.stabilis，B.ambifaria，B.hospital，B.terricola，B.sacchari，B.tropicalis，B.brasilensis，B.anthina，B.dolosa，B.cenocepacia，B.xenovorans，B.tuberum，B.phymatum。通过研究得知B.caryophylli，B plantarii，B.glumae，B.andropogonis是植物的致病病原菌，能够使不同种属的植物患上根腐、叶斑、条斑等病害。在不同植物中分离得到的B.vietnamiensis，B.kururiensis，B.tropicalis，B.brasilensis，B.tuberum，B.phymatum，B.caribensis有促进根瘤形成，增强固氮的能力，同时促进植物根的生长。B.mallei和 B.pseudomallei则能够引起人和动物的鼻疽病。对于B.glathei，B.graminis，B.phenazinium，B.caribensis，B.caledonica，B.hospital，B.terricola，B.sacchari在环境、生态中所起的作用还不是很清楚。同时，还有一些具有多重作用，可以是植物致病菌，植物有益菌或是人类的机会致病菌，例如：Burkholderia cepacia complex，Burkholderia gladioli 和 Burkholderia fungorum[34]。从20世纪90年代中期开始，一些研究者发现来源于各种环境的Bcc分离物具有明显的遗传异质性，1996年，有报道说利用分子鉴定和临床观察，发现伯克霍尔德菌至少有3个不同的基因型是CF病症的致病菌[35]。直到1997年，Vandamme等运用多相分类研究方法对从CF病人中分离到的致病菌进行研究，才发现所设定的B.cepacia种中，至少存在5种不同的基因型[36]。包括B.vietnamiensis（基因型V）、B.multivorans（基因型II）、基因型I，III和 IV。这5种基因型被统称为伯克霍尔德菌复合型（B.cepacia complex）。利用不同的方法从医学和环境微生物的角度对伯克霍尔德菌复合型进行了探索研究，其中包括使用不同的选择性培养基。结果发现，农业研究中利用的培养基，能从土壤和植物根际附近发现大量的伯克霍尔德菌复合型的族群[37]；在医学研究中，几乎无法从自然界中发现伯克霍尔德菌复合型的存在[38]。直到伯克霍尔德菌分类的又一次改变，才使这些固有的不同有机的联系起来，一些研究者发现基因型IV与Bcc中的其他基因型有明显的差异，于是被归类B.stabilis[39]。接着从美国和英国的CF致病菌中分离出基因型VI，它除了与B.multivorans没有差异外，与其他基因型均有差异[40]。从人类致病菌与环境中都能分离B.ambifaria（基因型VII），因此它也具有生防菌的特征。最近，发现B.pyrrocinia（基因型Ⅸ）也属于B.cepacia complex[41]。因此，已报道的洋葱伯克霍尔德菌复合型由9个不同基因型组成，分别是B.cepacia（基因型Ⅰ）、B.multivorans（基因型Ⅱ）、B.cenocepacia（基因型Ⅲ）、B.stabilis（基因型Ⅳ）、B.vietnamiensis（基因型Ⅴ）、B.dolosa（基因型Ⅵ）、B.ambifaria（基因型Ⅶ）、B.anthina（基因型Ⅷ）、B.pyrrocinia（基因型Ⅸ）。后来，Yabuuchi E等人在泰国某地的表层土中分离得到的B.thailandensis的一株，被重新归类为Burkholderia ubonensis，经过鉴定初步断定也归类为B.cepacia complex[42]。各基因型间DNA-DNA同源性为30%～50%，其16S rRNA 和recA 基因序列相似性很高，分别为98%～99%和94%～95%[43]。直到目前，对Bcc的基因型组成仍在研究中，Zhang L等人在玉蜀黍和水稻的根际发现了大量的Bcc菌株，并且通过Bcc recA基因的同源性的分析，发现分离所得的Bcc R456菌株可能属于一种新的基因型[44]。虽然能从不同的环境条件下分离获得大量的Bcc，但却不清楚Bcc株系主要的存活环境。事实上，只有很少的研究涉及环境中Bcc的生态特征，一些研究者也仅仅是对Bcc的一个或几个基因型进行研究[45]。现有的伯克霍尔德菌复合型中有许多有生防效果或是作为植物促生剂，现今生产B.cepacia生物农药的菌株都来源于环境，但问题是，对这些菌株是否是非致病菌也无法区分，因为除了Bcc基因型Ⅵ只能从CF病人中分离到，基因型Ⅸ只从土壤中分离到以外，其他所有基因型的B.cepacia均可从环境和医院中分离[46]。同样，无法很清楚的在菌株基因型或是表现型方面来区分环境菌和人类致病菌。同时，每年都可以从CF的致病菌中获得新的Bcc株系，并且也能够从自然环境中获得这些菌株[47]。因此，如何区分环境菌和人体致病菌以及其是否具有致病性，对应用于农业上的Bcc菌株进行风险评估是必要的，也将是今后的研究难点和热点之一。目前，对细菌的鉴定一般都先选择合适的选择性培养基培养分离出的样本，然后利用生理生化手段检测分离到的菌株，接着利用SDS-PAGE技术，全细胞蛋白电泳，16S rDNA序列分析手段鉴定出分离所得样本的属，最后配合RFLP探针技术或AFLP探针技术以确定菌株的基因型。现有的伯克霍尔德菌复合型由9个不同的基因型构成，各个基因型在形态上非常相近，这就需要非常便利的生物化学的鉴定手段和具有针对性的分子鉴定方法对各个基因型进行精确的区分[48]。利用16S rDNA测序、recA-RFLP分析、recA 基因特异引物PCR检测、DNA-DNA 同源性分析以及全细胞蛋白电泳（PAGE）方法可区分Bcc中的一些种，但还没有一种技术可以针对性的区分出每个基因型。因此，寻找一种简单可行可靠的鉴定技术是今后研究的热点之一[49]。Bcc致病毒力因子包括脂肪酶、蛋白酶、溶血素、脂多糖、过氧化氢酶、内毒素等，以紫花苜蓿作为植物模型研究Bcc的毒力，发现9个基因型中除了B.multivorans 和B.stabilis外，其余都可以从发病的紫花苜蓿上分离获得[50]。但植物与人类病原菌存在着差异，如革兰氏阴性人体条件致病菌绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和植物病原菌丁香假单胞菌（P.syringae）均存在Ⅲ型蛋白分泌系统，但后者对人和动物不致病，表明致病因子存在并不能充分说明其能致病。为了确定细菌致病性毒力的决定因子，Chung J W等人利用蛋白质组学描述来比较两种B.cenocepacia在老鼠肺上的存在状态，发现临床分离所得的C1394 很快被致死，C1394mp2依然存活。利用Two-dimensional（2D）凝胶电泳发现从易感病寄主上得到的C1394mp2，缺少烷基氢过氧化物还原酶亚基C（AhpC）蛋白位点，反之增加了鞭毛蛋白，这使C1394mp2增强了在高温和低pH值条件下的氧化应激能力。这揭示了B.cenocepacia致病毒力在易感模型上出现不同的表现与应激能力的内在原因[51]。对于使用易感动物作为模型进行研究是一个进步，但是对于动物模型的选择、如何利用等都受到时间、道德等原因的制约，寻找合适的动物模型仍是今后需要解决的问题之一。洋葱伯克霍尔德菌对于人本身来讲，是一种可怕的致病菌，不但污染医院的药品和器具，而且引起可怕的“洋葱伯克霍尔德菌综合征”。对于整个人类来讲，有好也有坏。它是自然界中一些植物的病原菌又是一种重要的生防、环保以及工业用菌，减少了对环境的危害，不少国家把它作为生物农药和环保制剂使用。如何区分哪些是人体致病菌、哪些是植物致病菌、哪些是生防或环保菌，成了一个令人困扰的问题。这有赖于对其生态多样性、致病机制以及分类学的全面了解。只有确定Bcc生防或降解菌株对人体不致病，或者该菌株为单独一个种而不是人体致病菌一员时，才能将其安全的应用于农业生产上，使其为人类造福。现在已经有许多研究者从不同的方面入手来进行研究，但仍有未涉及或很少涉及的领域，如该菌在自然界的分布及多样性研究，其基因型的详细鉴定及针对性的鉴定方法，这些都是需要注意的问题。因此，在今后的研究中，要广泛地参考结合各学科领域的研究进展，充分地认识了解该菌的生物学特性及在不同方面的风险性测试评价，以期更好地使其为人类服务。

川成都植物病害是由植物—病原—环境三者在一定适宜条件下，引起植物体发病，构成对植物正常生长发育和新陈代谢的干扰与破坏，最终造成植物的生物产量和经济产量减产，品质降低，给人类的农业、林业生产造成重大损失。植物病害的病原物是指能寄生于植物体并导致侵染性病害发生的生物。植物病害分成菌物（真菌）性病害、细菌性病害、病毒类病害、线虫类病害以及其他因素引起的植物病害。植物细菌性病害是植物病害中发生为害较重、发病规律比较难以掌握、防治技术要求高、防治效果很难凑效的一类病害。植物病原细菌是属于原核生物中的一个生物类群，它与真核生物在细胞结构及组成成分方面存在着较大的差异，正是这种细胞结构和组分上的差异，导致了细菌性病害比真菌性病害更难以防治。植物细菌性病害中比较著名的病害有：水稻细菌性条斑病、水稻白叶枯病、白菜软腐病、番茄青枯病、玉米细菌性枯萎病、柑橘溃疡病、梨火疫病、马铃薯环腐病。还有近年来被国际柑橘病毒学家确认的柑橘黄龙病等，这些植物细菌性病害给我国农业、林业生产带来了巨大的影响和危害。本文将对植物细菌性病害做了以下6个方面的初步探讨。早在2000多年前我国《诗经》中已经将生物划分成了植物、动物和蕈类三大类。1593年李时珍在《本草纲目》中将生物分成了植物、动物和人类三大类。在近代科学发展史上，以林奈为代表的生物分类学家将生物分成两界（即动物界Animaliae和植物界Plantae），这两界系统被人类科技界沿用了200多年。16～18世纪，随着显微镜发明和细胞学说的建立，人类才发现了单细胞生物——细菌。对于细菌在生物进化过程中，专家们普遍认为：细菌的出现应该是在植物和动物出现之前就已经存在了。1969年魏泰克将生物界分成五界系统，即：（1）以细菌为主的原核生物界；（2）以单细胞原生动物和藻类为主的原生生物界；（3）多细胞生物中以光合作用制造营养的植物界；（4）以多细胞为主吸收营养的真菌界；（5）多细胞生物中以摄取食物为营养来源的动物界。1974年黎德勒认为：取消原生生物界，将生物化分成四界系统，即：原核生物界、真菌界、植物界和动物界。1977年我国科学家陈世骧提出了生物学界的三总界构成六界系统，即：无细胞总界——（病毒界）；原核生物总界——（细菌界、蓝藻界）；真核生物总界——（真菌界、植物界、动物界）。1988～1989年（Cavalier-Smith），将生物学界划分成：两个总界组成的八界系统，即：一、细菌总界：①真细菌界；②古细菌界；二、真核总界：③古菌界；④原生动物界；⑤植物界；⑥动物界；⑦真菌界；⑧藻界。到2003年，他取消了古细菌界和古菌界，改为二总界六界学说。许志刚教授在2005年正式提出三域七界的最新分类体系，即无细胞生物域的病毒界；原核生物域的细菌界；真核生物域的原生生物界、真菌界、藻物界、植物界和动物界。反映了当前人们的认识水平。从上述分类系统可以看出，细菌的分类始终处于原核生物界内，它与真核生物在细胞结构及其组成成分上存在着许多本质上的差异。原核生物是以单位膜为界的，细胞核质无核膜包围，呈原核状态。含肽聚糖的细胞壁有或无；核糖体在细胞质内70S。染色体的数目为1。细菌的质粒DNA游离于细胞质中。细菌都是单细胞生物，它们的细胞膜外都有一层主要由肽聚糖（革兰氏阳性细菌）或脂多糖（革兰氏阴性细菌）构成的坚韧细胞壁。真核生物：具有以单位膜为界的细胞器，细胞壁不含肽聚糖。细胞核有核膜包围，呈真核状态，核糖体80S，在细胞器内的核糖体70S。细胞内有内质网、高尔基体、溶酶体、叶绿体有或无、有微管系统。染色体中有组蛋白；有核仁；要发生有丝分裂；细胞器有DNA（如线粒体）；配子能够融合；DNA不单向转移形成部分二倍体。最典型的是真核生物具有真正的细胞核以及其他细胞器组成成分。核是细胞的控制中心，它由核膜包着与核外的细胞质分开。核膜内有核仁和核质。植物病理学家们长期以来将植物细菌性病原种与对寄主的致病性作为一个非常重要的因素，同时要依据病原细菌的生理生化性状和血清学性状等指标来综合确定植物病原细菌的种。在《伯杰氏细菌学手册》第七版出版时已经命名的植物病原细菌种有200多种。根据生物学命名中优先命名权不能侵犯的原则，确定每一个新种必须查阅大量文献，以避免同物异名的出现。在《伯杰氏细菌学手册》第八版中将植物病原细菌种由原来的200多种削减为几十种，以保证所有种都可以用生化试验来进行鉴定并尽量保证能在实验室条件下可以重复实验，使之更具有科学性和重复性。1994年，根据《伯杰氏细菌学手册》第九版的系统分类：将细菌分成了四大类35个群。2000年以后，《伯杰氏细菌学手册》第二版分五卷陆续出版发行，该版本的最新分类体系中将细菌界包括了16门、26组、27纲、62目、163科、814属，共计4727种。植物病原细菌属于细菌界中普罗特斯门、放线菌门和厚壁菌门。普罗特斯门细菌细胞壁主要由脂多糖组成，肽聚糖含量较少，因而革兰氏染色阴性。放线菌门细菌的细胞壁中肽聚糖含量高，革兰氏染色阳性。厚壁菌门中的病原生物包括植原体（Phytoplasma）和螺原体（Spiroplasma）。已经描述的引起植物病害的原核生物有28个属。植物细菌性病害的病原菌主要分成五大类别。第一类：黄单胞菌属（Xanthomonas）。黄单胞菌属是细菌中的特殊类群，目前文献中描述的黄单胞菌属的种几乎都是植物病原细菌。它可以为害120多种单子叶植物和270多种双子叶植物。黄单胞菌引起许多重要植物病害，比较典型的病害有：（1）甘蓝黑腐黄单胞菌（X.campestris pv.campestris）；（2）水稻白叶枯病（X.oryzae pv.oryzae）；（3）水稻细菌性条斑病（X.oryzae pv.oryzicda）；（4）柑橘溃疡病（X.campestris pv.citri）。由黄单胞菌属细菌引起的植物病害大多数症状为叶枯、坏死、萎蔫等症状。第二类：假单胞菌属（Pseudomonas）。假单胞菌属细菌大多数都是土壤、水、其他基质上的腐生菌，有些是植物病原细菌。它的生态适应性广，表型差异大，是一个非常异质的组群。丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）是重要的植物病原细菌，能为害多种植物。在《伯杰氏细菌学手册》第九版中正式命名的植物病原细菌有7个种。第三类：欧文氏菌属（Erwinia）。欧氏菌属细菌是人类第一个发现的植物病原细菌。有史以来所发现的欧氏菌属细菌一部分是植物病原细菌，最常见的是各种植物的软腐病，也有萎蔫和坏死。典型的病害有：梨火疫病（E.amylovora）；玉米细菌性枯萎病（E.stewartii）；马铃薯和大白菜的软腐病等。由欧氏菌引起的细菌性软腐病在全世界均有发生分布。第四类：土壤杆菌属（Agrobacterium）。土壤杆菌属细菌是一类习居于土壤的细菌，在土壤中广泛的分布。常见的致病性细菌种有根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌。根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）能为害多种双子叶植物，在近土根茎部形成恶性肿癌。发根土壤杆菌（A.rhizogens），在侵染双子叶植物幼根后形成丛生的毛发状根群，称之为发根。第五类：棒形杆菌属（Clavibacter）。它是从棒状杆菌属（Corynebacterium）中分列出来的一个新属。国内发现的植物病原棒形杆菌属细菌中，最典型的病害有马铃薯环腐病菌（C.m.pv.sepeadonicum）在国内马铃薯产区均有分布。由于该病菌是以种薯传带的，所以在调运马铃薯种薯时必须要实施检疫。小麦蜜穗病菌（C.tritici）在国内华北冬麦区、山东、安徽、江苏、浙江、贵州等省已有发生。植物病原细菌从植物的气孔、皮孔、蜜腺等自然孔口以及伤口侵入寄主。植物细菌性病害主要见于高等被子植物和栽培植物上较多。植物病害的症状包括病状和病症两个方面。所谓病状：是指感病植物的外部特征，主要表现有：（1）变色：指整个植株、叶片或叶片部分变色。（2）坏死：指植物体局部细胞和组织的死亡。（3）腐烂：整个植物的组织和细胞被破坏和消解。（4）萎蔫：植物病害中的萎蔫是指植物的输导系统被病原物毒害或病组织的产物阻塞而造成不可逆转性的萎蔫。（5）畸形：感病植物组织和器官所发生的皱缩、卷曲、萎缩、丛枝、发根、肿瘤，花器和种子变态。所谓病症：是指病原物在病株发病部位上所表现的特征。主要表现有：（1）霉状物。（2）粉状物。（3）锈状物。（4）粒状物。（5）根状菌索。（6）菌脓。菌脓：是指发病部位产生的胶黏脓状物，干燥后形成白色的薄膜或黄褐色的胶粒。菌脓是细菌性病害在田间特有的病症。从多年田间病害症状诊断的实践环节看，植物细菌性病害田间症状诊断上着重注意几点：细菌性病害往往会出现局部坏死斑点，如柑橘溃疡病的病斑。腐烂：很多蔬菜类作物上出现的软腐病、马铃薯环腐病等。萎蔫：作物上出现的青枯病，全株性萎蔫。菌脓：如水稻细菌性条斑病病叶上出现的胶黏脓状物。细菌性病害往往不会出现整株变色、叶片上不会出现霉状物、粉状物、丛枝、萎缩等症状。细菌性病害会出现发根和肿瘤等症状。这个问题是一个非常复杂的问题，要回答好这个问题并非易事。从理论上探讨，所有植物病原细菌都可以通过种子传带。细菌附着在种子表面，也可以存活于种皮内，以及块茎组织内部。细菌在植物种子上一般存活1～2年。植物病原细菌一般产生胞外多糖，且一般具有鞭毛结构。因而，雨水的溅射和细菌自身在水中的游动可导致其传播。此外，随着灌溉水的流动，细菌可以在田块间传播。在20世纪60～70年代，水稻白叶枯病在四川省水稻产区流行蔓延，造成水稻产量严重减产，损失惨重。植物病原细菌可以通过苗木、接穗传播。嫁接工具、人为操作不当的行为均可以传播植物细菌性病害。柑橘溃疡病在我国柑橘主产省区均有不同程度地发生为害。狂风暴雨夹带雨滴是沿海岸线柑橘产区柑橘溃疡病蔓延猖獗的主要环境因素。通过媒介昆虫可以传带细菌性病害。柑橘黄龙病传毒主要媒介是柑橘木虱。要使柑橘黄龙病发生蔓延的几大因素是：一是要有柑橘黄龙病病树存在；二是要有传毒的媒介昆虫；三是要有感病的寄主。同时，昆虫的越冬寄主枳壳、九里香等存在为病菌的越冬和第二年的病菌的侵染循环创造了条件。如何掌握植物细菌性病害发病规律，作者认为应该注意以下几点：（1）植物的种子、苗木、接穗等一切繁殖材料均有可能携带植物细菌性病害的病原，并能在植物体表或表皮内较长时期的存活，是远距离传播植物细菌性病害的主要原因。（2）由于植物病原细菌的细胞有胞外多糖，在有水膜存在下可以加快细菌侵染速度，为害程度由点到片逐步加重。在雨季、大风、甚至飓风条件下加快了点片发生与为害的程度。（3）有灌溉水存在的条件下可以加快植物细菌性病害的流行蔓延，是大面积造成为害损失的主要诱因。（4）有媒介昆虫的发生、越冬寄主的存在，为植物细菌性病害的再次侵染循环奠定了基础和创造了条件。（5）嫁接工具、农事活动操作不当均可以造成寄主大量伤口，有利于病原细菌的侵入，导致田间植物细菌性病害近距离传播为害。（6）适宜的温湿度条件，加速了植物细菌性病害的侵染循环。根据植物细菌性病害发病的诱因和发病基本规律可以看出：种子、苗木可以带菌；细菌繁殖速度快、侵染途径多；远距离传播与近距离扩散相辅相成，加快了细菌性病害点、片发生，具有暴发成灾、损失严重的特点。植物细菌性病害很难防治，药剂防治效果很难奏效。四川省在防治水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等细菌性病害中都不是单一地采用药剂防治。药剂防治只能作为综合治理植物细菌性病害技术环节中的一个重要环节，特别是柑橘溃疡病防治技术中，国内外至今尚未见到仅仅依靠药剂防治来完全控制其为害蔓延的成功范例。柑橘黄龙病的综合治理更是如此。（1）建立无病虫种子、苗木繁殖基地，生产健康无检疫性病虫的种子苗木。（2）种子苗木调运前实施田间产地检疫和抽样实验室检验相结合，保证调出种子苗木是无病的。（3）调入地尽量集中成片种植，播种前进行种子消毒处理，有利于生产管理和病虫害综合治理。（4）加强田间病虫害预测预报，发现细菌性病害点、片发生时，及时拔除病株销毁，并用药剂对周围植株进行保护性防治。（5）严格对发病田块的肥水管理，防止有病田块流水串灌或漫灌。（6）对较大面积发生细菌性病害的发病区要及时隔离，防止上游流水继续向下游流传，造成更大面积的细菌性病害流行。同时对发病区要进行较大规模的药剂防治。（7）及时换种、加强轮作换茬，防止细菌性病害在田间菌量的不断积累和再次暴发成灾。（8）注意嫁接工具的消毒，防止农事活动中人为的传播感染。

近些年，由于多种原因的影响，小麦黑胚病发生日趋严重，已经成为生产上的重要问题。由于该病危害，导致小麦籽粒质量和等级下降，影响种子出苗和幼苗生长，已成为小麦生产亟待解决的问题之一[1～5]。一些研究报道，黑胚病的主要病原菌链格孢（Alternaria alternata）可以产生致病毒素，甚至能够引起食道癌变，对人类健康有很大的威胁[6]。虽然一些学者对小麦黑胚病的发病规律、品种抗性、防治技术以及黑胚籽粒对小麦出苗和生长的影响做了不少研究工作，但关于黑胚病菌链格孢的致病机制尚不清楚，对该病原菌的致病毒素未见报道[7～9]。对于毒素的致病机理，一些研究认为，是毒素造成了寄主植物某些生理生化方面的异常从而引起了病害症状[10～17]。本研究的目的是弄清小麦黑胚病优势病原菌链格孢所产毒素的生物活性和基本性质，了解病菌的致病机理，为进一步研究工作奠定基础。1.1.1 供试小麦品种 抗病品种：豫麦47、豫优1号、科优1号；感病品种：豫麦18、豫农9901、漯麦4号；种子由国家小麦工程技术中心和河南省农业科学院小麦所提供。1.1.2 供试菌株 小麦黑胚病菌链格孢（Alternaria alternata），由本实验室分离鉴定和保存。1.2.1 粗毒素的制备 转接黑胚病菌菌种于PDA 培养基上培养7d，然后取直径为6.5mm 大小的菌丝块，接种到150ml pH4的PSK液体培养基中（250ml三角瓶），每瓶一块，在25℃、110r/min恒温摇床上培养10～15天，至菌丝变黑。将培养液用滤纸过滤，滤液经高速离心，取上清液用0.45μm 微孔薄膜过滤，得无菌滤液。采用种子萌发和根长抑制法进行毒素生物活性测定。1.2.2 生物学活性测定1.2.2.1 病菌毒素对种子萌发的作用 选取饱满的小麦种子，用0.1%HgCl2进行表面消毒3min，然后用无菌水冲洗干净并用灭菌的滤纸将种子表面的水吸干。取直径9cm的培养皿，放入一张灭菌的滤纸，用5ml无菌滤液、1/4的稀释液、1/2的稀释液和2倍浓缩液的无菌滤液分别浸泡小麦种子，放置在（25±1）℃的培养箱中，3天后记载种子萌发率，以根长超过种子直径者计为萌发，计算种子萌发率和抑制率。抑制率（%）=（清水对照种子萌发率—处理种子萌发率）/清水对照种子萌发率×1001.2.2.2 病菌毒素对种子根生长的作用 选取饱满的小麦种子，加水浸泡12～24h时，倒掉水并用无菌水冲洗3遍后再放到25～26℃恒温条件下催芽。待主根长约2mm时，将种子胚向下摆在事先已铺有毒素浸湿的纱布（或滤纸）的培养皿内，再在种子上覆盖二层同样处理的滤纸，置25～26℃黑暗下培养48h，测定主根长度，并计算抑制百分率。1.2.2.3 病菌毒素滤液对小麦籽粒黑胚率和千粒重的影响 制备病菌孢子悬浮液（10×10倍显微镜下，20～30个孢子/视野）和粗毒素滤液，在扬花后5天、10天和15天分别喷洒到扬花前已套袋的小麦穗上，并在接种后再次套袋。选取3个感病品种和3个抗病品种，每品种每次接种20穗。收获后调查籽粒黑胚率及千粒重。1.2.3 病菌毒素的理化性质测定1.2.3.1 毒素粗提物中蛋白与非蛋白部分的活性测定 在培养滤液中加入2倍体积的甲醇，随后将该培养滤液于10℃下3000r/min离心20min，得到含蛋白质的沉淀（即蛋白部分）和不含蛋白质的上清液（即非蛋白部分）。用蒸馏水将蛋白部分稀释至原培养液体积，非蛋白部分用旋转蒸发仪于60℃下减压蒸发充分除去甲醇后，也用蒸馏水稀释至原培养液体积，分别检测其生物活性，每处理3次重复，以未经处理的培养滤液和清水为对照。1.2.3.2 毒素的酸碱稳定性测定 将毒素培养滤液的pH值用1mol/L NaOH和HCl分别调至3、4、5、6、7、8、9、10。于常温下放置24h后，再调回原值，在60℃水浴中浓缩至原体积，进行活性检测。每处理2次重复，以未经处理的培养滤液和清水为对照。1.2.3.3 毒素的热稳定性测定 将无菌滤液分别于60、80和100℃水浴中处理20min、30min、40min、50min和60min，或于121℃高压灭菌处理20min，用无菌蒸馏水补足损失水分后，检测其生物活性。每处理2次重复，以未经处理的无菌滤液和清水为对照。1.2.4 毒素提取物对小麦种子几种酶活性的影响 选取饱满的小麦种子，表面消毒后置于培养皿中，用浓缩2倍后的无菌滤液处理种子，分别在处理前，处理后3h、6h、12h、24h、36h和48h取样进行酶活测定。1.2.4.1 多酚氧化酶（PPO）提取与活性测定 称取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。加入2ml 0.02mol/L的磷酸缓冲液（pH6.8），于4℃下4000r/min离心15min，上清液即为PPO粗提液。取粗提液100μl，加入pH6.8磷酸缓冲液1.5ml，混匀后于30℃水浴中保温10min。然后加入0.02mol/L邻苯二酚1.5ml，立即计时，于分光光度计398nm下测其3min内OD变化值，以每分钟增加0.01个OD值定义为一个酶活性单位（U），对照为3ml的磷酸缓冲溶液。各样品均重复测定3次。1.2.4.2 过氧化物酶（POD）提取与活性测定 取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。加入2ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH6.0），于4℃下4000r/min离心15min，上清液即为POD粗提液。采用愈创木酚法，在470nm波长下测定吸光值，然后以每分钟每克鲜重OD值变化1.0所需的酶量为一个酶活单位（U），对照为3ml的磷酸缓冲液。各样品均重复测定3次。1.2.4.3 SOD酶活性测定 取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。取4ml的SOD反应液与小烧杯中，加入50μl酶提取液，在加200μl核黄素，混匀（以pH7.8磷酸缓冲液代替酶液作为对照）。在光下反应10min，黑暗终止反应，与560nm下测吸光值。测定结果表明，病菌培养滤液对种子萌发和小麦根系的生长都有明显的抑制作用。培养滤液原液种子根伸长抑制率高达90.18%，对种子萌发抑制率也达到65.0%。浓缩两倍的培养滤液对种子萌发抑制率高达100%，种子根生长抑制率达到99.27%。随着培养滤液浓度的降低，对种子萌发和根系生长抑制率也逐渐下降（表1）。培养滤液浓度平均种子萌发率（%）平均种子萌发抑制率（%）平均根长（cm）平均根长抑制率（%）培养滤液2倍浓缩液0e100.000.02c99.27培养滤液原液35.00d65.000.27c90.18培养滤液1/2稀释液70.00c30.001.18b57.09培养滤液1/4稀释液87.50b12.502.74a0.27清水对照100.00a—2.75a—表1 链格孢毒素培养滤液对小麦种子萌发和根系生长的影响利用病菌孢子悬浮液和病菌毒素滤液分别接种处理小麦穗部，在收获后统计籽粒黑胚率，结果发现病菌孢子悬浮液和病菌毒素滤液处理籽粒黑胚率均比清水对照显著提高，其中病菌孢子悬浮液接种黑胚率高于毒素滤液处理，且扬花后5天和10天接种病原菌发病较厉害。（表2）。处理处理时间（天）感病品种抗病品种漯麦4号豫农9901豫麦18豫麦47豫优1号科优1号CK（套袋）—2.41f3.77e2.35e2.87f0.78e0.79e毒素滤液扬花后5天3.00e6.28d4.24d6.78e2.13c0.95e扬花后10天4.81c15.61c8.53b10.44c2.71b1.51c扬花后15天3.85d6.63d2.82e9.57cd1.60d1.19d孢子悬浮液扬花后5天10.00a19.71a13.61a16.40b2.76b3.03a扬花后10天3.93d15.33c5.86c8.72d2.88b1.54bc扬花后15天6.69b18.28b7.80b18.42a4.36a1.76b表2 链格孢毒素滤液和孢子悬浮液处理后小麦籽粒黑胚率 （%）利用病原菌孢子悬浮液和毒素培养滤液分别处理6个小麦品种的麦穗，发现有些品种籽粒千粒重明显下降，损失率最高达到32.27%，与清水对照差异十分显著。而且，用毒素处理的小麦籽粒千粒重的影响还要大于接种病原菌孢子悬浮液的影响（表3）。处理处理时间（天）感病品种抗病品种漯麦4号豫农9901豫麦18豫麦47豫优1号科优1号CK（套袋）—48.17a47.85a48.28a48.03a47.57a42.32a毒素滤液扬花后5天46.70b36.65d42.83c32.53e41.33c35.37cd扬花后10天36.53c41.20b42.53c34.23d39.39d36.75c扬花后15天46.39b38.58cd40.55d35.01d33.72e33.83e孢子悬浮液扬花后5天46.79b40.11bc44.74b42.98c43.22b35.37cd扬花后10天47.11ab42.76b42.98c45.50b38.28d40.03b扬花后15天46.40b40.39bc41.39cd45.26b33.73e34.33e表3 链格孢毒素滤液和孢子悬浮液处理后千粒重2.4.1 病菌培养滤液中蛋白与非蛋白部分的活性测定 由实验结果可以看出，培养滤液中蛋白等大分子物质部分对种子萌发没有抑制作用说明该部分无致病活性，而非蛋白部分队种子萌发抑制率则与培养滤液原液相似，说明其保留了病原菌培养滤液的致病活性（表4）。处理滤液蛋白部分滤液非蛋白部分培养滤液原液清水对照平均种子萌发率（%）98.3a47.33b46.67b100.00a平均种子萌发抑制率（%）1.7052.6753.330表4 小麦黑胚链格孢代谢物中蛋白部分和非蛋白部分的活性2.4.2 毒素的酸碱稳定性 测定结果表明，用不同pH值处理链格孢培养滤液24h后，其生物活性几乎不受影响，对种子萌发的抑制率都达到50%以上，与培养滤液原液没有明显差异，说明小麦黑胚病链格孢毒素具有较强的酸碱稳定性（表5）。滤液pH值345678910原液清水对照平均种子萌发率（%）46.67b50.00b48.33b45.00b45.00b48.33b45.00b46.67b46.67b100.00a平均种子萌发抑制率（%）53.3350.0051.6755.0055.0051.6755.0053.3353.33—表5 不同pH处理后链格孢培养滤液对种子萌发的活性2.4.3 毒素的热稳定性 由表6可以看出，小麦黑胚病菌培养滤液于60、80和100℃水浴中处理20min、30min、40min、50min和60min处理后活性与没有处理的对照几乎没有差异，而且在121℃下处理20min仍不失活，说明其热稳定性较强。温度处理（℃）处理时间（min）203040506012158.33a———10050.00a51.67a51.67a51.67a51.67a8051.67a55.00a53.33a53.33a51.67a6050.00a53.33a51.67a50.00a51.67a常温55.00a50.00a51.67a50.00a51.67a表6 不同温度处理后链格孢培养滤液对种子萌发的抑制率 （%）链格孢毒素对小麦种子多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的影响见表7。测定结果表明，随着时间的延长，不论是感病品种还是抗病品种在毒素滤液处理后PPO、POD和SOD的活性均下降，且抗病品种较感病品种下降慢。从3种酶活性测定结果来看，SOD活性在毒素滤液处理后下降更为明显。时间（h）PPOPODSOD豫优1号豫农9901豫优1号豫农9901豫优1号豫农9901028.0031.8323.5022.17214.04181.61328.8326.1722.0020.67204.10143.82623.0024.0018.8319.33198.70136.381222.0022.8317.6718.67179.67124.482420.1719.3317.3317.67154.9894.263619.0017.6718.0016.33115.4589.734817.1716.5017.0016.83112.1192.06表7 毒素滤液处理对小麦种子酶活性的影响 （单位：U/min·g）初步研究结果表明，小麦黑胚病菌可以产生致病毒素，该毒素能够抑制小麦种子萌发和根的伸长，并能加重黑胚病的发生，而且能够降低籽粒千粒重，初步结果表明病菌的致病作用与其产生的毒素有关，但是其机制有待进一步研究。对毒素基本性质的研究是进行纯化的基础。虽然本实验研究的毒素是未经提存的粗毒素，但是能够揭示其一般的特性。本实验结果表明，小麦黑胚病链格孢毒素为非蛋白类物质，而且是一种热稳定性及酸碱稳定性均较高的物质。这为以后研究和利用毒素提供了理论依据。SOD、POD、PPO这三种酶是存在于膜系统中的一种抵御活性氧伤害的保护酶，寄主在与病原菌或毒素的相互识别斗争过程中，会产生高出正常水平的活性氧，干扰正常的代谢功能，在正常情况下，活性氧都保持在一个动态平衡状态[11～12]。毒素处理小麦种子之后PPO、POD、SOD的活性均降低，可能由于毒素造成了活性氧清除系统中这三种酶系统的破坏，活性氧过量积累，细胞受到伤害，从而也抑制了种子的萌发。小麦黑胚病菌链格孢毒素的致病作用可能是一个比较复杂的过程，除了本实验研究的几种酶的作用外，还需对其他一些相关酶、细胞膜透性、酚类代谢、氧化磷酸化、细胞器结构等很多理化机制和细胞学结构变化等进行深入研究。同时，也要加强对毒素纯化和结构分析等方面的工作，为进一步研究毒素的性质和作用机理奠定基础。

培育抗病品种是一种经济有效的手段，成为解决苹果炭疽菌叶枯病的首选。传统的抗病育种主要依赖于植株的表现型选择 （P he-notypical selection），但是由于环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素大大影响表型选择效率。如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等条件的影响。一个优良抗病品种的培育往往需要花费7～8年甚至十几年时间。随着分子生物技术的快速发展，以DNA多态性为基础的分子标记技术以其表现稳定、数量多、多态性高等优点已被广泛的运用于植物遗传图谱的构建、控制重要农艺性状基因的标记遗传定位、种质资源的遗传多样性分析以及品种指纹图谱的绘制等方面，尤其是分子标记辅助选择 （molecular marker-assisted selection，MAS） 育种，相较传统育种能极大地提高育种的选择效率与育种预见性，受到人们的高度重视。简单重复序列 （simple sequence repeats，简称 SSR） 又称微卫星（microsatellite） 广泛地分布于果树基因组的不同位置。SSR位点多态性的形成是基于基本单元重复次数的不同。由于每个SSR位点两侧一般都具有相对保守的单拷贝序列，所以可以根据此特点在SSR两侧序列设计一对特异引物来扩增 SSR 序列。通过对 PCR 产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳来显示不同 SSR 标记的分子多态性。由于SSR标记具有大量的等位差异、多态性好、操作简便、稳定等特点，已被广泛应用于作物的遗传图谱构建、指纹图谱绘制、目标性状基因的标记定位、物种起源进化及品种纯度鉴定等 （Hemmat，1994）。本试验利用SSR标记与集团分离分析法BSA （bulk segregant anal-ysis） 相结合，快速有效地寻找与质量性状遗传的目标基因紧密连锁的SSR标记，用于分子标记辅助育种及抗病性的早期鉴定。本试验选择青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 2009年种植的，经过室内离体接种鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的207 株F1杂交群体实生树为材料，于2015 年4 月底，每株采摘幼叶 5～6 片，用液氮处理后，置于-70℃冰箱保存。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进 （附录一）。（1） 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。取 4μl DNA 样品与 2μl 6×Lodding buffer 混匀，在 1%浓度的琼脂糖凝胶中电泳 （120V，30min），最后在紫外凝胶成像系统中成像并记录保存。若成像为一条整齐、单一、清晰的 DNA 条带，且点样孔没有亮光，则表明所提样品较纯；若条带不清晰、拖尾或出现涂抹带，则表明 DNA 发生了降解，降解严重会看不到条带；若在胶片下部有弥散的荧光区出现，则表明样品中存有 RNA 杂质；若点样孔处有明显的亮光，则说明样品中含蛋白质和大分子杂质。琼脂糖凝胶电泳检测方法见附录二。（2） 分光光度计检测。运用分光光度计NanoDrop 2000 进行 DNA纯度及浓度的量化测定。若 OD260/OD280 值在 1.8～2.0，并且 OD260/OD230 值大于2.0，则表示此样品DNA纯度适宜。将提取、纯化的基因组 DNA，稀释到浓度为10ng/μl。根据该组合群体的离体接种鉴定结果，将杂交后代单株分为抗病和感病两大类型。按照BSA分析方法的要求，选取 10 份高抗单株 （无任何病斑）的DNA，等量混合构建DNA抗池；选取10份高感单株 （病斑个数大于20） 的DNA等量混合构建DNA感池。两个基因池用于筛选与目标基因连锁的分子标记。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载目标区域的 contig 序列，然后通过网站 http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool搜索该区域碱基序列中所有的 SSR 位点。搜索参数设置为：碱基重复单位为 2、3、4、5、6 个碱基，相应的重复次数依次为 8 次、6 次、4 次、3 次、3 次。利用 Primer 3.0 P lus软件设计SSR引物，引物设计时应注意：引物与SSR位点间的距离一般大于50 bp 个碱基序列。引物 GC 含量为40%～70%，最适值为50%；引物长度在18～24 bp；退火温度50～65℃，左右引物退火温差小于 5℃；扩增产物片段大小在 150～350 bp。引物的评估利用Oligo软件进行，避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生。引物序列 （附表1）。所有引物由生工生物工程 （上海） 股份有限公司合成。SSR反应体系为15 μl，内含10 ng/μl基因组DNA 2 μl，1×Master Mix 7.5 μl，0.2 μmol/L左右引物各0.8 μl。进行初步筛选时的 PCR扩增程序为：94℃预变性 5min，然后按 94℃变性 30 s，55℃退火40 s，72℃延伸30 s的程序进行 10 个循环，每个循环的退火温度降低0.5℃，然后按94℃变性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸30s的程度进行25个循环，最后72℃延伸8 min，筛选能扩增出有差异条带的SSR引物。最终筛选的 PCR 扩增程序为：94℃预变性 5min，然后按94℃变性30 s，相应的退火温度40 s，72℃延伸30 s的程序进行35个循环，最后72℃延伸8 min，4℃保存。PCR产物使用3.5%的琼脂糖凝胶电泳，或者聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法见附录三。从 HiDRAS 网站 （http：//www.hidras.unimi.it/） 和 GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank） 网站下载了 300 对均匀分布于苹果17条染色体上的已发表的 SSR 引物，在亲本及抗感池中进行初步筛选，选出在抗亲、抗池与感亲、感池中有多态性条带的引物，然后在207个做图群体上进行筛选。最终选出与抗性基因位点连锁的标记，根据所筛选出的SSR标记的已知信息，确定其所在的染色体，然后将 SSR 标记序列与苹果基因组数据库 （http：//www.rosaceae.org） 进行BLAST比对，将其定位在染色体的具体位置上。初步定位后，从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus x domestica/下载与目标基因位点连锁的 SSR 标记间的 contigs序列，根据SSR标记设计的方法，设计了 276 对新引物。这些引物首先在抗亲、抗池与感亲、感池中进行筛选，将产生多态性条带的引物再进行群体验证。对检测群体中各单株的 SSR 标记基因型分别赋值并记录，与抗池带型相同的记为 “A”，与感池带型相同的记为 “B”。将这些SSR标记在群体上的基因型数据进行孟德尔1R∶1S遗传符合度的卡方检验。并将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合，采用 JoinMap 4.0软件，对标记及抗性基因 R gls位点的连锁关系进行分析。利用软件中的Kosambi函数功能将重组率转化为遗传距离，其他参数设置为默认值。将筛选获得的与抗性基因 R gls位点最近的两个 SSR 标记，在两个亲本上进行PCR扩增。将差异片段进行胶回收。回收产物连接到载体pMD-19T simple，然后转化到大肠杆菌进行扩繁。将菌液PCR检测为阳性的克隆送生工生物工程 （上海） 股份有限公司测序。每个样挑取3个单菌落作为测序重复。测序结果用 DNAMAN 软件进行比对分析。具体操作方法见附录四。用CTAB法提取的苹果叶片基因组 DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，DNA条带清晰，完整无降解 （附图3-1）。可以用于后续的研究。从 HiDRAS 网站 （http：//www.hidras.unimi.it/） 下载的 300 对均匀分布于苹果17条染色体上的已发表的 SSR 引物在亲本及抗感池中进行初步筛选，选出54 对在抗亲、抗池与感亲、感池中有多态性条带的引物。再将这54 对引物用于作图群体的207 个单株以筛选与抗性基因位点连锁的 DNA 标记。最终筛选出2 个可以清晰区分抗感双亲、抗感池和杂交群体抗感单株的 DNA 标记，CH01d08 和CH05g05。引物序列如表3-1中所示，因为这两个标记已被报道位于苹果15号连锁群上 （Liebhard et al.，2002），所以将苹果炭疽菌叶枯病抗性基因 （命名为Rgls） 位点定位于15号连锁群上。连锁分析表明这两个标记分别位于Rgls基因位点两侧，通过 BLAST算法与苹果基因组数据库 （http：//www.rosaceae.org） 进行比对，SSR 标记 CH01d08位于15 号染色体的 Contig MDC021953.346 上，标记 CH05g05 位于MDC016699.237 上，物理位置分别位于染色体的 2343 kb 和13699 kb处，两个标记覆盖了染色体上11.3Mb区域 （表3-1）。根据苹果基因组 CH01d08 和 CH05g05 标记之间的核苷酸序列，自行设计了276对SSR引物。按照上述方法进行筛选，最终筛选出9对引物能够扩增出清晰稳定的多态性条带的引物 （附图3-2、附图3-3），分别为 S0607039、S0607001、S0506206、S0506001、S0506078、S0405195、S0405127、S0304673、S0304011 （表3-1）。连锁分析表明，标记S0405127和S0304673与Rgls基因位点的距离最近，位于该基因两侧，分别存在2个、4个重组个体。通过对这11个SSR标记在做图群体上的基因分型比例分析，符合 1R∶1S 的理论比值， P 值大于0.05 （表3-2）。SSR编号引物序列重复基序产物长度/bp退火温度/℃位点CH01d08aF：5′-CTCCGCCGCTATAACACTTC-3′R：5′-TACTCTGGAGGGTATGTCAAAG-3′ag29056MDC021953.346chr15∶13688903..13699651CH05g05aF：5′-ATGGGTATTTGCCATTCTTGC-3′R：5′-CCTGAAGCAAGGGAAGTCATAC-3′ag14356.5MDC016699.237chr15∶2343805..2349433S0607039F：5′-AACGCACCGACCCATTTC-3′R：5′-CCAGCTCGCATAACCACC-3′ct18654MDC011529.272chr15∶6103161..6122652S0607001F：5′-ATGAAAGCGAGTCGGAGTG-3′R：5′-GGGGAGGGTTGGTGGTTA-3′caggtcaggt26956MDC004171.329chr15∶5986277..6005012S0506206F：5’-GCTGAGATTTCCCCCATT-3′R：5′-GCTGCGGACACTGCTTAG-3′ttggatgtg24354MDC007696.347chr15∶5714203..5748693S0506078F：5’-AGAAAGGCCCTCAAACAG-3′R：5′-CTGCAGAAGGTGGGTATG-3′aaaagc30455MDC002692.183chr15∶5005415..5011924S0506001F：5′-CATGAAAAGGTAGGCAGTGG-3′R：5′-GAGGTTCTTGGGCAAGTGTT-3′acaaccaa30454MDC013564.245chr15∶5006247..5017709S0405195F：5′-AGACGGGCAAATTAGTTGAGAT-3′R：5′-TCCCTTCTATGATGAATGACACC-3′tg25853MDC016041.193chr15∶4672532..4691912S0405127F：5′-GGCACAATGTAGGAGGGATA-3′R：5′-GCTATGAGGAAATTGGCTCT-3′at33055MDC043871.6chr15∶4622388..4626535S0304673F：5′-GTTTGCACATTGTAATGCTG-3′R：5′-CAGTTTTCTAGTGATGTCGTTG-3′tg（ga）33353MDC013859.580chr15∶4121053..4135560表3-1 定位在15号连锁群上与Rgls基因连锁的SSR标记序列及引物SSR编号引物序列重复基序产物长度/bp退火温度/℃位点S0304011F：5′-GCCGAATCTGCGGAATTG-3′R：5′-TCCCACTTCCTCACCGTCTC-3′ag21056MDC015994.315chr15∶3183972..3196801表3-1 定位在15号连锁群上与Rgls基因连锁的SSR标记序列及引物（续）-1SSRmarkerObservedratio(R∶S)Expectedratio(R∶S)x2PS030401184∶123103.5∶103.53.670.06Ch05g0590∶117103.5∶103.51.760.18S030467393∶114103.5∶103.51.070.30S040512791∶116103.5∶103.51.510.22S040519588∶119103.5∶103.52.320.13S050607894∶113103.5∶103.50.870.35S050600192∶115103.5∶103.51.280.26S060700188∶119103.5∶103.52.320.13S060703998∶109103.5∶103.50.290.59S050620695∶112103.5∶103.50.70.40Ch01d08104∶103103.5∶103.500.96表3-2 SSR标记在207株 ‘金冠’ב富士’ F1 群体中的分离将Rgls位点附近的11个SSR标记在 ‘金冠’ב富士’ 杂交组合F1 群体的207个单株上进行连锁分析。将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合采用 JoinMap ver.4.0软件计算出重组率和遗传距离如附图3-4 所示。连锁图谱上标记的顺序依次为 S0304011、CH05g05、S0405195、S0304673、S0405127、S0506078、S0506001、S0506206、S0607001、S0607039、CH01d08，重组率分别为：13.0%、8.7%、5.3%、1.9%、1.0%、6.8%、6.8%、7.2%、7.7%、8.7%、24.6%。遗传距离分别为15.4 cM、7.2 cM、3.1 cM、0.9 cM、0.5 cM、3.0 cM、4.8 cM、6.4 cM、8.2 cM、10.7 cM和33.8 cM。 Rgls基因被定位于 S0304673 和S0405127之间。距离目标基因最近的标记为 S0405127，在抗性基因Rgls位点与S0405127标记之间仅发现两个重组个体，遗传距离为0.5 cM。S0304673 的遗传距离为 0.9 cM。在 ‘Fiesta’בTotem’-15 （F×T） （Fernández-Fernández et al.，2008） 的遗传图谱中，SSR标记CH05g05与Ch01d08的遗传距离为33.7 cM，而在本研究中二者之间的遗传距离为41.0 cM （附图3-4）。为了确定抗性基因Rgls位点的物理位置，将11 个标记序列与金冠苹果染色体基因组序列 （http：//www.rosaceae.org） 进行 BLAST 比对，确定这些标记位于15号染色体上的2.3～13.6 Mb。 Rgls被定位于标记S0405127和S0304673之间，跨度为4.1～4.6 Mb，两标记间的物理距离为500 kb （附图3-5）。对S0304673 和 S0405127 进行测序分析。S0304673 标记能够在双亲中扩增出差异条带，而 S0405127 标记只在 ‘金冠’ 上扩增出一条带，所以对S0304673 标记在双亲中的扩增产物进行了测序，而只对S0405127标记在 “金冠” 上的扩增产物进行了测序 （附图 3-6、附图3-7）。测序结果表明，SSR标记 S0304673 和 S0405127 的扩增片段大小分别为333 bp和330 bp。标记S0304673在 ‘富士’ 中的扩增片段比在 ‘金冠’ 中的扩增片段存在三处8～10 bp的碱基缺失，分别是 CT-CAGTGTGT、AGAGAAAG、CTTCTTACTT，另外还存在着一处两个碱基差异和六处单碱基差异。在 ‘金冠’ 中的扩增片段与参考基因组序列比对发现，有两处单碱基的差异，分别为 A/T和 G/A的碱基变化。标记S0405127在 ‘金冠’ 中的扩增片段与参考基因组序列比对发现，除在参考基因组中有两未知碱基以外，其余完全一致。本次测序确定了参考基因组序列的两处未知碱基分别为G和A。集团分离分析法 （BSA法） 是分子标记研究中的最经典的研究方法之一。其最大的贡献在于能够快速、有效地检测到与目的基因相连锁的分子标记，能够在连锁图谱中标记稀疏区或末端寻找到新的标记，并以此作为侧翼标记 （flanking marker），为继续寻找更紧密的连锁标记、构建高分辨率的连锁群、物理图谱和进行基因的图位克隆奠定基础 （廖毅，2009）。其原理简单、操作方便，而且克服了许多物种没有或者难以创建近等基因系的限制，被广泛地应用于作物育种中。同时必须注意到，物种基因组大小对标记与目标基因连锁距离是有影响的，一般来说基因组大，多态性少的物种，获得与目标基因紧密连锁标记的可能性也比较小。BSA法所能检测到的分子标记与目标基因的可信遗传距离一般在 15～25 cM，所以此法并不是在每一物种上都能获得所需要的目的标记 （Mackay and Caligari，2000）。DNA池的质量对BSA法的检测效率也有很大的影响。所以在实验过程中一定要注意，一是保证DNA 的纯度和浓度。杂质会影响紫外光的吸收率，高浓度的 DNA 溶解不均匀。因此混池时，尽可能使用高纯度 DNA，并适当稀释，否则会影响分池的精确性。二是避免 DNA 池污染。DNA 污染的原因有多方面，包括基因重组率、本身的表型效应、性状鉴定误差、DNA 混合误差、PCR 效率不均等。我们可以通过减少PCR 循环次数、减少混池单株数、构建多池、重复实验等方法来降低实验误差，否则这些误差将会导致多态性被覆盖而找不到目标标记。随着分子生物学技术的快速发展，许多分子标记被成功的应用于控制农艺性状的重要基因的遗传定位及遗传图谱的构建。如 RAP D标记、RFLP 标记、SCAR 标记、CAPs 标记、SSR 标记、SNP 标记等。在这些标记中，SSR标记具有重复性好、可靠性高、共显性和适合自动化操作等优点，成为基因定位和遗传图谱构建的首选。而且，SSR标记广泛从布于整个基因组。据统计，大约有163426个 SSR 位点公布在苹果17条染色体上 （关玲等，2011）。苹果基因组序列的公布，使SSR标记的批量开发及相应引物的设计变的更加便捷 （Guan et al.，2011）。人们可以利用已有的 SSR标记对整个基因组进行筛查，快速的将目标基因所在区域进行锁定。然后在该区域查找SSR并设计合成新的引物，进一步缩小基因所在范围。在本研究中，576 个 SSR 标记，包括300对以前发表的标记和276 对新开发的标记被首次应用于抗炭疽菌叶枯病基因位点的定位。从300对已发表并定位的SSR标记中成功的获得了2 个与抗性基因 Rgls位点连锁的 SSR 标记，CH01d08和CH05g05。这两个标记被定位于 ‘Fiesta’בTotem’ 遗传图谱的第15条染色体上的基因组序列 MDC021953.346 和 MDC016699.237上，位于抗性基因 R gls位点的两侧。这一初步定位的结果为后续标记的开发提供了非常重要的信息，明确了 R gls基因所在的染色体及区域范围。随后9个位于CH01d08和CH05g05之间与Rgls位点连锁的新标记被开发出来。最近的标记与抗性基因 R gls位点间的遗传距离为0.5 cM。在前人的研究中，SSR标记 CH01d08 和 CH05g05 被定位在 ‘Fi-esta’בTotem’ 的遗传图谱中，遗传距离为 33.7 cM.而在本研究中，它们间的遗传距离为41.0 cM。这种类似的现象Paolo等 （2013）也报道过。他们在利用四个分离群体构建与柱型基因 Co位点紧密连锁的遗传图谱时发现，特定标记间的遗传距离会因不同群体，甚至同一群体不同群体大小而不同。这有可能是由于采样不同或遗传因素控制的局部的和全基因组的重组频率不同造成的 （Doligez et al.，2006；Vezzulli et al.，2008；Moriya et al.，2009）。理论上，标记在基因组上的遗传位置与物理位置应该是对应的。但是在本研究中发现，部分标记的遗传位置与物理位置并不是一一对应的。从附图3-4和附图3-5中可以看出，共有8个SSR标记的连锁图谱上的位置与在 ‘金冠’ 基因组序列中的物理位置是一致，另外3个标记，S0506078、S0405195 和 S0304011在遗传图谱上的位置与物理图谱上的位置不一致。这有可能是由于当前的苹果基因组重叠群序列产生装配错误，也有可能是苹果基因组中染色体结构的变异造成的。对引物S0405127 和 S0304673在亲本金冠的扩增片段进行测序发现，所测序列中有四处碱基与参考基因组存在差异。这四个差异碱基及上述的三个与理论顺序不符的标记有可能会纠正基因序列组装错误。在本研究中位于抗性基因 Rgls位点两侧的标记 S0405127 和S0304673间遗传距离与物理距离的对应关系显示，1.4 cM 对应着500 kb个碱基 （物理距离/遗传距离=357 kb/cM）。在对苹果抗黑星病基因Vf位点的分子标记遗传定位的研究结果中显示，每cM 的遗传距离对应423～857 kb的物理距离 （Patocchi et al.，1999）。而在对控制苹果柱型基因 Co位点的遗传定位研究中，每 cM 的遗传距离对应702 kb的物理距离 （Paolo B et al.，2013）。这与本研究中所得出的结论不相符。这有可能与研究材料的群体大小、DNA提取的纯度及表型鉴定的准确性有关。本研究中所利用的SSR标记，特别是新设计的276 对引物，有很大比例在亲本间能扩增出多态性条带，而在抗感池间无差异。虽然这部分标记与抗性基因 R gls不存在连锁关系，但仍可用于群体遗传图谱的构建，以及其他性状标记的筛选。在对PCR产物的检测中，使用了3.5%的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方式。采用3.5%的琼脂糖凝胶电泳条带清晰，分辨率高，可以清楚的显示差异条带，而且操作简单，电泳速度快，但是存在显示的条带少的缺点。而聚丙烯酰胺凝胶电泳产生的条带很多，分辨率极高，甚至能分离1 bp的碱基差别，但是制备和操作复杂。本试验主要采用3.5%的琼脂糖凝胶电泳，所以可能会导致一些引物因产生的多态性条带间差异小，没有显示出来而被淘汰。本研究首次开展了与抗炭疽病叶枯病基因 R gls位点紧密连锁的分子标记的筛选，并构建了第一张与抗性基因 R gls位点紧密连锁的分子标记遗传图谱。通过对207株 ‘金冠’ב富士’ 杂交组合F1 群体的验证，11个与Rgls位点连锁的标记将该基因定位在苹果基因组第15条染色体上，覆盖了49.2 cM的遗传距离，标记S0405127 和 S0304673分别位于抗性基因位点的两侧，遗传距离分别为 0.5 cM 和 0.9 cM，对应于 ‘金冠’ 苹果基因组的物理距离为500 kb。这两个标记可以应用于抗炭疽菌叶枯病分子标记辅助育种，在定植前对幼苗进行抗性筛选。这将会显著的降低苹果抗炭疽菌叶枯病育种的成本，缩短育种时间。本研究结果对深入开展抗炭疽菌叶枯病的遗传机理和分子机制研究有重要的意义，并为进一步的抗性基因的图位克隆和基因功能验证奠定基础。