核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）所致的油菜菌核病是毁灭性的。抗病性鉴定方法是抗病材料筛选和育种的关键。本研究探讨了一种有效的田间病害圃鉴定筛选的方法，该方法中维持适中的病害压力是鉴定区别油菜品系抗性的关键。病害圃中每年连作油菜，在播种前每行施两粒菌核。在开花期利用喷雾系统喷雾保湿。于成熟期按0～4级分级调查病害。在两年的试验中，90个品系发病率在3.3%～100%。发病率和病情指数在重复之间显著相关。小区的病情指数和相对抗性指数基本为正态分布。研究结果表明该方法是有效的、有用的和灵敏的。Sclerotinia sclerotiorum causes a highly destructive disease in oilseed rape(Brassica napus).Methods for identification of resistance to S.sclerotiorum are crucial to screening and selection of resistance materials.In the study,we described a field disease nursery method efficient for resistance screening of breeding lines or germplasm of oilseed rape where maintaining of a suitable disease pressure is considered to be most important in order to differentiate levels of resistance existed in different lines.In the disease nursery,S.sclerotiorum inoculum had been maintained by growing oilseed rape consecutively and by placing two sclerotia in each row before sowing in each of the previous four seasons.During the flowering time,all plants were sprayed with water using a spray system.At maturity,disease severity was assessed on a 0~4 scale and disease index was calculated.In tests of two years,percent diseased plants of 90 lines(3 replicates in each year)ranged from 3.3%~100%.The percent of diseased plants and disease indices were significantly correlated between replicates(P<0.05).The frequency distributions of both disease indices(each plot)and relative resistance indices were in a normal form while the frequency distribution of percent diseased plants was negatively skewed.These data indicated that the method is efficient and useful to differentiate resistance of oilseed rape varieties.

水稻条纹叶枯病由灰飞虱传播的发生严重的水稻病毒病。该病2004年在浙江长兴突然发生，全县发病面积为663.3hm2，发病较重的田块丛病率达50%以上，株病率达17.6%，一般丛病率在10%左右，株病率在1%～5%，其中产量损失10%～30%为21.7hm2，损失30%以上为2.79hm2，涉及15个乡镇，个别严重田块颗粒无收。2005年水稻条纹叶枯病以较快的速度蔓延，6月中旬在长兴夹浦、洪桥、虹星桥、雉城等乡镇的单晚秧田和早播直播稻相继发病，部分严重田块株病率超过25%，7月10日左右，出现第二个症状表现高峰，移（抛）栽稻、直播稻不同程度发病，发病面积达1万hm2，其中66.67hm2损失产量20%以上。针对水稻条纹叶枯病流行的严峻形势，为了有效地控制病害暴发流行，确保水稻生产安全，从2005年起，我们对水稻条纹叶枯病及传毒媒介灰飞虱发生动态进行较为系统的监测，开展了防治技术的研究。现将调查试验结果综述如下：在前一年发病较重的田畈，选取有代表性的田块对水稻条纹叶枯的发生情况进行定期跟踪调查，以观察水稻条纹叶枯病的田间消长规律。从田间调查来看，秧田从6月上旬后期开始发病，6月15日出现第一个症状表现高峰；移栽到大田后，6月23日调查，丛病率为6%，株病率为0.89%，病情指数为0.08，至7月10日左右出现第二个症状表现高峰；以后随着发病株的枯死和分蘖的增加，丛病率和株病率都呈下降趋势，株病率下降相对较快，8月20日左右出现第3个症状表现小高峰（见图1、图2）。从田间发病调查情况看，发病程度最重在7月底，见图3。图1 水稻条纹叶枯病丛发病率增长动态（浙江长兴）图2 水稻条纹叶枯病株病发病率增长动态（浙江长兴）图3 水稻条纹叶枯病病情指数增长动态（浙江长兴）2005年灯下监测，5月中旬成虫开始上升，6月中旬出现了第2代成虫高峰，诱虫量大，诱虫量为2936头，7、8月出现了3、4代成虫的小高峰，9月出现了5代成虫高峰，9月中旬和下旬分别诱到成虫1522头和1722头，10月还有大量的成虫出现，见图4。图4 灯下灰飞虱成虫消长情况（浙江长兴，2005）2006年灯下监测，5月上旬灯下始见，下旬成虫开始上升，迁入水稻秧田为害，6月上旬后期至中旬出现了第2代成虫高峰，为全年虫量最高，诱虫达6337头，7月上旬、8月上旬又出现了3、4代成虫的小高峰，8月底至9月初后灯下虫量上升，出现了5代成虫高峰，诱到成虫1520头；10月灯下诱虫量减少，见图5。图5 灯下灰飞虱成虫消长情况（浙江长兴，2006）2005年4月22日麦田调查，越冬代虫量为5.4万头/hm2，6月16日秧田虫量为13.05万头/hm2，6月21日平均卵量480万粒/hm2，6月28日秧田虫量为4.05万头/hm2，7月下旬虫量为1.05万头/hm2，8月上中旬虫量为0.45万头/hm2，9月上旬虫量为1.5万头/hm2，9月15日虫量为4.05万头/hm2，9月20日虫量为7.5万头/hm2，9月26日虫量为16.5万头/hm2，9月30日虫量为25.5万头/hm2，10月5日虫量为33万头/hm2，10月10日虫量为27万头/hm2，10月15日虫量为10.95万头/hm2。2006年4月上旬麦田调查，越冬代虫量为15.9万头/hm2，6月30日秧田虫量为16.95万头/hm2，7月3日秧田虫量为8.55万头/hm2，7月中下旬田间虫量下降，8月1日虫量为8.55万头/hm2，8月14日虫量为19.95万头/hm2，8月25日虫量为17.25万头/hm2，8月28日虫量为20.1万头/hm2，9月8日虫量为24万头/hm2，9月下旬虫量上升，9月25日为153.45万头/hm2，9月29日虫量为28.55万头/hm2，10月虫量还比较高，10月8日虫量为48万头/hm2，10月12日虫量为31.5万头/hm2，10月17日虫量为30万头/hm2。田间灰飞虱消长曲线见图6。图6 田间灰飞虱发生消长情况（浙江长兴，2006）灰飞虱的发生量和带毒率对水稻条纹叶枯病的发生有着密切的关系，近年来，随着灰飞虱发生量增加和带毒率的提高，水稻条纹叶枯病发生面积扩大，发生程度加重。据测定，2005年长兴县灰飞虱带毒率斑点免疫快速测定为11.27%，2007年达18%。水稻灰飞虱生物法测定传毒率，2006年为6.7%，2007年为7.4%。田间观察，5月中下旬的1代灰飞虱成虫传毒造成秧田和部分早播直播田（5月下旬播种）发病，至6月中旬左右出现了水稻条纹叶枯病的第一个显症高峰；6月上旬后期至中旬的2代灰飞虱成虫高峰造成了7月中旬左右的水稻条纹叶枯病的第2个显症高峰，由于6月上旬后期至中旬的灰飞虱成虫高峰量较大，因此，7月10日左右水稻条纹叶枯病表现高峰来势凶猛，发病面积大，发病程度重；8月中旬在病情发展上有一个小高峰，如2006年8月7日左右个别失治田块出现了第3个症状表现高峰，株病率达20%以上。以后随着水稻的生长，抗逆能力增强，田间虽有大量的灰飞虱成若虫，但基本不发病。水稻条纹叶枯病的防治应立足于预防，采取“抗、避、断、治”的综合防治措施。在目前水稻对条纹叶枯病防治还没有高抗品种的情况下，重点要切断灰飞虱的传毒途径。为此，我们围绕灰飞虱的防治开展一系列的农业防治措施和药剂防治试验，根据水稻条纹叶枯病的感病期，强化药剂浸种、拌种处理和秧苗期、大田前期灰飞虱的防治，配合使用病毒钝化剂，水稻条纹叶枯病得到了有效地控制。在条纹叶枯病重发区，推广秀水63、秀水09等抗病性好的品种，压缩武运粳7号、加育991等感病品种种植。浙江长兴1代灰飞虱成虫迁移高峰期在5月中下旬，推迟至6月上旬播种的直播稻可避开大部分1代灰飞虱的迁入传毒，减少发病机率。水稻条纹叶枯病的感病期主要在秧苗期，水稻秧田期的灰飞虱防治尤其重要。因此，要及时清除农田周边杂草，5月上旬前冬闲田提前翻耕，减少灰飞虱中间寄主，恶化灰飞虱生存环境，抓好麦田灰飞虱的防治，麦田收割后及时灌水翻耕，并抓好“四边”杂草中灰飞虱的防治。同时抓好药剂浸种、拌种处理的秧田期和大田前期的灰飞虱防治。坚持“治杂草和麦田保秧田、治秧田保大田、治大田前期保大田后期”的策略。经过几年来的试验示范，防治灰飞虱以5%锐劲特45～50ml/667m2、40%毒死蜱100～120ml/667m2、50%稻丰散100ml/667m2，加水50kg喷雾防治为佳。在浸种灵浸种的基础上，催芽露白后每千克种子用35%丁硫克百威（稻拌成、稻伴）种子处理干粉剂5g拌种，混拌均匀后播种，随拌随用。在水稻发病前和发病初期，配合使用病毒钝化剂2%菌克毒克100～150ml/667m2防治1～2次，减轻水稻发病程度，减少水稻产量损失。

Plant and fungal cells are surrounded by a cell wall rich in diverse polysaccharides and proteins.It has become apparent in recent years that the carbohydrates in the cell wall function not only to maintain cell shape and integrity,but also may serve as signals in plants(Mohnen et al.,1993).Oligogalacturonic acid(OGA),a well studied elicitor,is derived from plant cell walls(Nothnagel et al.,1983).When added to cultured plant cells,it induces an oxidative burst within minutes,releasing ROS via a pathway that involves receptor binding,activation of a G-protein,influx of Ca2+,stimulation of phospholipase C,and induction of a number of kinases(Apostol et al.,1989;Horn et al.,1989;Legendre et al.,1992;Chandra et al.,1995;Legendre et al.,1993).Purified OGAs 13 to at least 26 residues long stimulate pp34 thiophosphorylation in vitro(Philippe et al.,1995).OGAs are also involved in the induction of the jasmonate pathway during plant defense response to E.carotovora subsp.Carotovora attack(Cecilia et al.,1999).The first response observed after the addition of OGAs that is clearly involved in plant defense is the production of active oxygen species,including H2O2,and O2-.This response,termed the oxidative burst,occurs within a few minutes after the addition of OGAs to suspension-cultured soybean,tobacco,and tomato cells.Reactive oxygen species are thought to have direct(through cytotoxicity)and indirect(through signaling)roles in the plant cell death required for the HR.Reactive oxygen species induce the expression of defense related genes,and are implicated as second messengers that elicit other defense responses,including systemic acquired resistance(SAR)and the HR(Brent etal.,2001).Different elicitors are thought to activate different sets of second messengers.The two signaling events that appear to participate in the OGAs inducing plant defense include the oxidative burst and NO accumulation.Inhibitors of mammalian nitric oxide synthase reduced both OGA-induced NO ac-cumulation and NOS activity,suggesting that OGA-induced NO production occurs via a NOS-like enzyme(Hu et al.,2003). Nitric oxide(NO)is a highly reactive molecule that rapidly diffuses and permeates cell membranes.During the last few years NO has a significant role in plant resist-ance to pathogens by triggering resistance-associated cell death and by contributing to the local and systemic induction of defense genes.NO stimulates signal transduction pathways through protein ki-nases,cytosolic Ca2+mobilization and protein modification(María et al.,2004). Most of the ex-perimental data available on NO detection during plant-pathogen interactions come from studies of infections by biotrophic pathogens(María et al.,2004). Additionally,an increase in NOS activity correlated with the pathogen resistance response has been observed in resistant tobacco during TMV infection( Durner et al.,1998;Chandok et al.,2003).Here we report that OGAs induced a range of defense responses in tobacco,including oxidative burst,NO accumulation and stimulation of superoxide dismutase(SOD)activity and catalase(CAT)activity.Furthermore,we show that tobacco plant sprayed with OGAs developed a resistance against infection by tobacco mosaic virus.We also provide evidence that the defense response induced by OGAs was connected with H2O2 and NO pathway.Plants of tobacco(Nicotiana tabacum var.sam sun NN)were grown from seeds in a greenhouse and were used at the 4~6-leaf stage after 2 months in culture.The plants were kept in a growth chamber at(23±1)℃ with a photoperiod of 16 h and 70%~80%relative humidity for several days before treatments.Diphenylene iodonium(DPI),2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES),Sodium nitroprusside(SNP),catalase(CAT,from bovine liver),NG-nitro-L-arginine-methyl eater(L-NAME)and 4,5-diaminofluorescein diacetate(DAF-2 DA)were obtained from Sigma.2′,7′-dichlorofluorescin diacetate(H2DCF-DA)from Biotium.All other reagents were from Shanghai Chemical Reagent CO.,LTD,Tianjin Kermel Chemical Development Centre,or Beijing Chemical Plant.OGAs was prepared from enzymatic hydrolysis of pectin and separated with membrane according to the report(H Zhang et al.,1999).An aliquot of OGAs was dissolved in water and analyzed with a matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometer(MALID-TOF-MS,Bruker,Germany).Tobacco mosaic virus(TMV)that came from our collection was multiplied in N.tabacum.TMV was extracted from systemic infected plants by homogenization of infected leaves in 0.05mol/LH3PO4 buffer(0.05mol/L KH2PO4,0.05 M Na2HPO4 pH 6.8)with subsequent clarification of the extract by centrifugation at 2000g for 6 min.The supernatant extract was used for mechanical inoculation.All leaves of plant were sprayed with 50μg/ml of OGAs,the control plants were sprayed with water.24h~25d after OGAs application,plants were inoculated mechanically with TMV.The lesion caused by TMV was investigated at 7d after inoculation.Results were analyzed using Duncan's multiple range test at P= 0.05.For measurements of SOD and CAT activities,tobacco leaves treated with OGAs were kept in liquid nitrogen.The enzymes in the frozen powders were extracted by adding 0.05g polyvinylpyrrolidone and 5ml 0.05mol/L sodium borate buffer at pH 8.8 and homogenized at 4℃.SOD activities were measured as described by Zhu Guanglian(Zhu Guanglian et al.,1990).CAT activity was determined using the method of Beers&Sizers(Beer et al.,1952).NO and H2O2 measurement was performed using their fluorescent indicator dye DAF-2 DA and H2DCF-DA as described previously by H.Kojima(H.Kojima et al.,1998)with slight modifications.The epidermis was peeled carefully from abaxial surface of the leaves and cut into 5-mm length.Epidermal strips were placed into Tris/KCl buffer(Tris 10 mmol/L and KCl 50mmol/L,pH 7.2)containing DAF-2 DA at a final concentration of 10μmol/L for 30min,or H2DCF-DA at 50μmol/L for 10min,at 26℃ in the dark.The epidermal sections were removed and transferred to a dish of fresh Tris/KCl buffer(without probe)to wash off excess fluorophore apart from light.Then the epidermal strips were placed in Tris/KCl buffer containing OGAs and inhibitors.Examination of peels was performed using laser scanning confocal microscopy(Leica,TCS SP2)with exciting wavelength 488 nm,emitting wavelength 505~530nm.Plants were sprayed with 0.01 and 0.1 mmol/L of sodium nitroprusside(SNP),50μg/ml of OGAs,1 mmol/L,10mmol/L and 100 mmol/L H2O2,H2O2 scavenger catalase(CAT,100unit/ml)and OGAs cotreatment,H2O2 scavenger ascorbic acid(0.1mmol/L)and OGAs cotreatment and NOS inhibitor L-NAME(1mmol/L)for 30min before OGAs respectively.The control plants were sprayed with water.In all cases,24h after OGAs and other materials applications,plants were inoculated with TMV.The lesion caused by TMV was investigated at 7d after inoculation.The effect of OGAs,SNP and H2O2 on local infection was calculated from the ratio of the number of local lesion produced on the treated leaves to that on the control leaves treated with water.The TOF-MS profiles of OGAs sample were showed in Figure 1.The mass spectrum indicated that peaks corresponding to the mass numbers of( M+ Na)+of trimer to enneamer were detected.So the sample was composed mainly of OGAs having degree of polymerization( DP)2-8.Figure 1 TOF-MS of oligochitosan sampleThe results of control effects on TMV with OGAs at different concentration(50～100μg/ml)showed that the best concentration was 50 μg/ml(data not shown).The effects of application of OGAs at different time were summarized in Table 1.It was found that tobacco leaves treated with OGAs were protected against TMV infection.When the inoculation occurred at 19d after spraying 50μg/ml OGAs on tobacco plants,the relative control effect was 53.42%.We concluded that the resistance induced by OGAs became better with the inducing time until 19d.The resistance was reduced after 19d.Dayof50μg/mlgalacturonideappliedNumberoflesioncausedbyTMVRelativecontroleffect(%)vcdsaw1d125±5814.40a?4d116±3920.55a?7d120±4217.81a10d84±3742.47ab13d97±4433.56ab16d90±3238.36ab19d68±3453.42b22d71±3451.37b25d89±3739.04bck146±51—Table 1We examined the effects of OGAs on the activity of plant resistance correlated enzymes.The results(Figure 2 and Figure 3.)indicated that OGAs increased activity of SOD and CAT compared with the H2O-treated ones.There are no distinct differences on the activity of POD and PPO of tobacco leaves treated with OGAs or water(data not shown).SOD and CAT are concerned with eliminating oxygen free radical.Within one hour,activities of CAT and SOD were induced to maximum.Figure 2 Time course of SOD activity in tobacco leaves treated by 50μg/ml OGAs or H2O as CKFigure 3 Time course of CAT activity in tobacco leaves treated by 50μg/ml OGAs or H2O as CKBecause of activity of SOD and CAT induced by OGAs and the two enzymes correlative with oxygen free radical,we examined the production of H2O2 induced by OGAs.To study the effects of OGAs on the production of H2O2 in tobacco cells,the H2O2-sensitive fluorophore H2DCF-DA were used.The results of production of H2O2 in epidermal cells of tobacco leaves induced by OGAs were shown in Figure 4.It was found that OGAs caused an increase of intracellular H2DCF-DA fluorescence in epidermal cells and guard cells of tobacco leaves,indicating the production of H2O2.Fluorescence became visible along the plasma membrane and in organelles in the epidermal cells of tobacco leaves treated with OGAs(Figure 4C),but the fluorescence was very faint in the epidermal cells only loaded with H2DCF-DA(Figure 4A).The Figure 4E and G showed that CAT and DPI could inhibit the level of H2DCF-DA fluorescence in the cells of tobacco leaves treated with OGAs.The results revealed that CAT and DPI could suppress the production of H2O2.Figure 4 Laser scanning confocal microscopy of OGA-induced production of H2O2 in epidermal cells of tobacco leaves. (A) The cells loaded with H2DCF-DA. (B) Bright field image of the cells loaded with H2DCF-DA. (C) The cells loaded with H2DCF-DA before treatment with OGA. (D)Bright field image of the cells loaded with H2DCF-DA before treatment with OGA. (E) The cells loaded with H2DCF-DA and elicited by OGA in the presence of the CAT. (F) Bright field image of the cells loaded with H2DCF-DA and elicited by OGA in the presence of the CAT. (G) The cells loaded with H2DCF-DA and elicited by OGA in the presence of the DPI. (H) Bright field image of the cells loaded with H2DCF-DA and elicited by OGA in the presence of the DPI.The NO-sensitive fluorophore DAF-2DA was used to observe NO accumulation.The observed LSCM results of OGAs-induced production of NO in epidermal cells of tobacco leaves were shown in Figure 5.It was found that OGAs could enhance the level of intracellular DAF-2DA fluorescence in epidermal cells of tobacco leaves,indicating massive production of NO.Production of NO and/or accumulation was observed in organelles and along the plasma membrane in the epidermal cells of tobacco leaves treated with OGAs(Figure 5C).However,the DAF-2DA fluorescence indicating production of NO was not observed in the epidermal cells only loaded with DAF-2DA(Figure 5A).The results also indicated that CPTIO and L-NAME could inhibit the level of H2DCF-DA fluorescence in the cells of tobacco leaves treated with OGAs(Figure 5E and G).The results representedthat CPTIO and L-NAME could suppress the production of NO.Figure 5 Laser scanning confocal microscopy of OGA-induced production of NO in epidermal cells of tobacco leaves. (A) The cells loaded with DAF-2 DA. (B) Bright field image of the cells loaded with DAF-2 DA. (C) The cells loaded with DAF-2 DA before treatment with OGA. (D) Bright field image of the cells loaded with DAF-2 DA before treatment with OGA. (E) The cells loaded with DAF-2DA and elicited by OGA in the presence of the CPTIO. (F) Bright field image of the cells loaded with DAF-2DA and elicited by OGA in the presence of the CPTIO. (G) The cells loaded with DAF-2DA and elicited by OGA in the presence of the L-NAME. (H) Bright field image of the cells loaded with DAF-2DA and elicited by OGA in the presence of the L-NAME.As H2O2 and NO appear to be a key factor associated with plant induced defense disease,it was interesting to test the effect of exogenous NO and H2O2.The effect of OGAs,NO donor SNP and H2O2 at different concentrations and some scavengers are summarized in Figure 6.It was found that treatment with OGAs,SNP and H2O2 protected tobacco leaves against TMV local infection.The least lesion was observed at the treatment of 50μg/ml OGAs among the all treatments.The inhibition effect of H2O2 showed dependence on the amount of H2O2.The lesion of co-treatment of OGAs and the H2O2 scavenger CAT or ascorbic acid on TMV infection was as high as CK.We also observed SNP inducing resistance was dose-dependent.When the tobacco plants were treated with L-NAME before OGAs,the induced resistance was depressed.Therefore,we can presume NO and H2O2 are important factors participating in OGAs inducing resistance to TMV.Figure 6 Effect of OGAs and exogenous NO and H2O2 on disease symptomPectic oligosaccharides,produced by microbial enzymes,are well-known oligosaccharins,eliciting defence responses in diseased plants(Dumville et al.,2000).A broad spectrum of OG-induced pathogenesis-related defense responses has been reported(M.T.Esquerré-Tugayé et al.,2000).Most defense and developmental responses are induced by OGAs with a degree of polymerization(DP)between 10 and 15 galacturonic acid residues.OGAs with a DP less than 8 can also trigger defense responses in plants:they induce accumulation of protease inhibitors(T.Moloshok et al.,1992),ethylene production(S.D.Simpson et al.,1998)and elicitation of genes involved in jasmonic acid metabolism in tomato(C.Norman et al.,1999).In this report,we observed the OGAs with a DP between 2~8 could induce tobacco resistance to TMV.The concentration of OGAs used was also discussed.OGAs-induced plant growth has been reported(LoSchiavo et al.,1991;Filippini et al.,1992),and the maximal effect to growth was about 10-4 M(Stephen et al.,1993).To elicit plant defense responses,OGAs concentration higher than those usually required for control developmental process.In our experiments,50μg/ml was the best concentration to induce resistance within 100μg/ml(data not shown).It showed the efficiency of the OGAs in inhibition of virus infection was not depended on the dose of OGAs.But the inhibition effect was dependent on the treatment time.We observed the inducing effect of resistance to TMV was gradually elevated before 19d,but the mechanism of this needed further study.Research showed that lag period of the induced resistance of glucohexaose was about 7days and the protection period was about 28 days(Li Hongxia et al.,2005).Furthermore,tobacco plants treated by sulfated fucan or linear β-1,3 glucan showed resistance to TMV or bacterium E.carotovora after 5 days(Olivier Klarzynski et al.,2003;2000).So far no oligosaccharides were reported to have so long time inducing effect.Therefore,OGAs have more predominance to be applied in agriculture.Experimental results also showed that NO and H2O2 played important roles in OGAs inducing tobacco resistance to TMV.NO and H2O2 as important signaling active molecules in pathogen defense reaction has been extensively studied(Levine et al.,1994;Mehdy et al.,1996;Baker et al.,1995;Jabs et al.,1996;Delledonne et al.,1998;Rout-Mayer et al.,1997?;Binet et al.,1998).First,we examine the activity of plant resistance correlated enzymes.Because the activity of PAL has been confirmed elevated by many reports(Messiaen et al.,1994;Lapous et al.,1998;Dixon et al.,1989;Tepper et al.,1990),we just mensurated the PPO,POD,SOD and CAT.This includes the activity of SOD and CAT elevated,so we estimated the extra H2O2 production.To evaluate the stimulatory effect of OGAs on tobacco cells,we measured the production of H2O2 and NO in tobacco cells.The data indicated that OGAs induced the production of H2O2 and NO in epidermal cells of tobacco within a short time.These results were in agreement with the reports by Xiangyang Hu,who claimed OGAs stimulated NO accumulation in the growth medium of ginseng suspension cultures(Hu et al.,2003).Rout-Mayer and Binet discovered respectively H2O2 production within a few minutes after the addition of OGAs to suspension-cultured tobacco cells(Rout-Mayer et al.,1997;Binet et al.,1998).Many reports show H2O2 and NO exist are correlated to plant defense.H2O2 is involved in the induction and/or execution of hypersensitive reaction(C.S.Bestwick et al.,1997).H2O2 is required for the cross-linking of plant cell wall components as a part of the structural defense response(C.Lamb et al.,1997).The production of H2O2 may also lead to the development of an antimicrobial environment within the apoplast(M.Peng et al.,1992).In many cases,H2O2 collaborate with NO to execute invading pathogens.H2O2 and NO production were induced almost at the same time by cryptogein,a fungal elicitor(Foissner et al.,2000).NOS inhibitors compromise the hypersensitive resistance response in Arabidposis and tobacco(Delledonne et al.,1998?;Huang et al.,1998).TMV infection could elevate NOS(nitric oxide synthase)activity,and NO could induce PR-1 expression(Durner et al.,1998).NO,as well as other ROS,have been shown to stimulate the accumulation of SA(Durner et al.,1999),which play a critical signaling role in the activation of plant defense responses after pathogen attack.Furthermore,to test whether OGAs functions on inducing resistance in tobacco via NO and H2O2 pathway,we examined the effects of OGAs,exogenous NO donor SNP and H2O2 on inducing resistance to TMV.It was found that all of these treatments reduced lesion caused by TMV.But co-treatment with OGAs and H2O2 scavenger CAT or ascorbic acid blocked the inducing resistance.The tobacco plants inhibited NOS activity by L-NAME were not induced resistance by OGAs.So the defense response induced by OGAs was connected with NO and H2O2 pathway.The study reported herein reveals that OGAs can induce the production of H2O2 and NO,and induce the defense response against TMV.Our understanding of OGAs induced resistance is sketchy.The mechanisms of OGAs eliciting defense responses of tobacco need further investigation.

正向（经典）遗传学是通过生物的表型来推测其遗传物质的组成、分布和传递规律等，而反向遗传学是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论和技术，通过核苷酸序列的定点突变、缺失和插入等创造突变体并研究突变所造成的表型效应。随着基因组测序技术、侵染性克隆的构建技术、定点突变技术和报告基因的使用等，反向遗传学技术在研究植物病毒基因功能、侵染过程和致病机理等方面的应用越来越广泛。本文报道了该技术在研究马铃薯Y病毒（PVY）HC-Pro和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）P22功能方面的部分结果。PVY HC-Pro基因由本实验室提供，SPCSV的有关基因由芬兰赫尔辛基大学Valkonen教授提供，PVX201质粒由Baulcombe教授提供。突变试剂盒（Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）购自STRATAGENE公司，大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存，PCR突变引物由赛百盛公司合成。Figure 1 Symptoms of Nicotiana benthamiana plants inoculated with different constructs based on PVX 201将SPCSV P22、P28和RNaseIII等基因克隆到PVX201载体上，根据接种后出现的症状判断哪个基因能增强PVX对本氏烟的致病力。将PVY HC-Pro克隆到PVX201载体上，针对HC-Pro的KITC和IGN等位点设计合适的突变引物，参考突变试剂盒（Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）说明进行突变。通过测序证实所得突变体的准确性。大量提取法提取质粒PVX201、PVXHC或相应的突变体，摩擦法接种本氏烟（Nicotiana benthamiana），观察所致症状的差别。PVX201载体在本氏烟上引起轻微的斑驳和褪绿花叶症状，但不引起植株的死亡。SPCSV P28和RNase III等基因连接到PVX201后对症状无影响，但P22能提高PVX对本氏烟的致病力，导致了接种植株的死亡，说明P22是致病性的增强子。携带P22的PVX（PVX-p22）首先在接种叶上引起坏死斑点。坏死斑点扩展后，沿着叶脉到达茎部，引起上部组织坏死，最终导致本氏烟整株枯死。RNA沉默抑制因子HC-Pro也能提高PVX对本氏烟的致病力。表达HC-Pro的PVX（PVX-HC）在接种后7天出现严重明脉和卷曲，10～14天时首先心叶出现坏死，随后整株萎蔫死亡。但在接种叶上没有坏死斑，看不到明显的扩展迹象。KITC是HC-Pro的一个重要基序，参与病毒的蚜虫传毒、协生和抑制RNA沉默等过程。我们在测定烟草脉带花叶病毒（TVBMV）全基因组序列时发现，TVBMV（YND分离物）HC-Pro KITC基序中的K变成了R，而且也有蚜虫传毒活性。我们把PVY HC-Pro的KITC突变成RITC后，再接种本氏烟，发现该突变仍能引起本氏烟植株的死亡。把K突变为A（突变体1，K52A）后，突变体也能引起本氏烟死亡，说明HC-Pro KITC基序中的K可能不参与和PVX的协生。但把KITC基序中的C缺失后（突变体2，C55Del）就不能引起植株死亡，说明KITC基序中的C对于协生作用是不可缺少的。对于HC-Pro其他突变体的功能分析正在进行中。

培育抗病品种是一种经济有效的手段，成为解决苹果炭疽菌叶枯病的首选。传统的抗病育种主要依赖于植株的表现型选择 （P he-notypical selection），但是由于环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素大大影响表型选择效率。如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等条件的影响。一个优良抗病品种的培育往往需要花费7～8年甚至十几年时间。随着分子生物技术的快速发展，以DNA多态性为基础的分子标记技术以其表现稳定、数量多、多态性高等优点已被广泛的运用于植物遗传图谱的构建、控制重要农艺性状基因的标记遗传定位、种质资源的遗传多样性分析以及品种指纹图谱的绘制等方面，尤其是分子标记辅助选择 （molecular marker-assisted selection，MAS） 育种，相较传统育种能极大地提高育种的选择效率与育种预见性，受到人们的高度重视。简单重复序列 （simple sequence repeats，简称 SSR） 又称微卫星（microsatellite） 广泛地分布于果树基因组的不同位置。SSR位点多态性的形成是基于基本单元重复次数的不同。由于每个SSR位点两侧一般都具有相对保守的单拷贝序列，所以可以根据此特点在SSR两侧序列设计一对特异引物来扩增 SSR 序列。通过对 PCR 产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳来显示不同 SSR 标记的分子多态性。由于SSR标记具有大量的等位差异、多态性好、操作简便、稳定等特点，已被广泛应用于作物的遗传图谱构建、指纹图谱绘制、目标性状基因的标记定位、物种起源进化及品种纯度鉴定等 （Hemmat，1994）。本试验利用SSR标记与集团分离分析法BSA （bulk segregant anal-ysis） 相结合，快速有效地寻找与质量性状遗传的目标基因紧密连锁的SSR标记，用于分子标记辅助育种及抗病性的早期鉴定。本试验选择青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 2009年种植的，经过室内离体接种鉴定的 ‘金冠’ב富士’ 的207 株F1杂交群体实生树为材料，于2015 年4 月底，每株采摘幼叶 5～6 片，用液氮处理后，置于-70℃冰箱保存。参考Doyle和Doyle （1987） 及 Cullings （1992） 提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进 （附录一）。（1） 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。取 4μl DNA 样品与 2μl 6×Lodding buffer 混匀，在 1%浓度的琼脂糖凝胶中电泳 （120V，30min），最后在紫外凝胶成像系统中成像并记录保存。若成像为一条整齐、单一、清晰的 DNA 条带，且点样孔没有亮光，则表明所提样品较纯；若条带不清晰、拖尾或出现涂抹带，则表明 DNA 发生了降解，降解严重会看不到条带；若在胶片下部有弥散的荧光区出现，则表明样品中存有 RNA 杂质；若点样孔处有明显的亮光，则说明样品中含蛋白质和大分子杂质。琼脂糖凝胶电泳检测方法见附录二。（2） 分光光度计检测。运用分光光度计NanoDrop 2000 进行 DNA纯度及浓度的量化测定。若 OD260/OD280 值在 1.8～2.0，并且 OD260/OD230 值大于2.0，则表示此样品DNA纯度适宜。将提取、纯化的基因组 DNA，稀释到浓度为10ng/μl。根据该组合群体的离体接种鉴定结果，将杂交后代单株分为抗病和感病两大类型。按照BSA分析方法的要求，选取 10 份高抗单株 （无任何病斑）的DNA，等量混合构建DNA抗池；选取10份高感单株 （病斑个数大于20） 的DNA等量混合构建DNA感池。两个基因池用于筛选与目标基因连锁的分子标记。从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_domestica/下载目标区域的 contig 序列，然后通过网站 http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool搜索该区域碱基序列中所有的 SSR 位点。搜索参数设置为：碱基重复单位为 2、3、4、5、6 个碱基，相应的重复次数依次为 8 次、6 次、4 次、3 次、3 次。利用 Primer 3.0 P lus软件设计SSR引物，引物设计时应注意：引物与SSR位点间的距离一般大于50 bp 个碱基序列。引物 GC 含量为40%～70%，最适值为50%；引物长度在18～24 bp；退火温度50～65℃，左右引物退火温差小于 5℃；扩增产物片段大小在 150～350 bp。引物的评估利用Oligo软件进行，避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生。引物序列 （附表1）。所有引物由生工生物工程 （上海） 股份有限公司合成。SSR反应体系为15 μl，内含10 ng/μl基因组DNA 2 μl，1×Master Mix 7.5 μl，0.2 μmol/L左右引物各0.8 μl。进行初步筛选时的 PCR扩增程序为：94℃预变性 5min，然后按 94℃变性 30 s，55℃退火40 s，72℃延伸30 s的程序进行 10 个循环，每个循环的退火温度降低0.5℃，然后按94℃变性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸30s的程度进行25个循环，最后72℃延伸8 min，筛选能扩增出有差异条带的SSR引物。最终筛选的 PCR 扩增程序为：94℃预变性 5min，然后按94℃变性30 s，相应的退火温度40 s，72℃延伸30 s的程序进行35个循环，最后72℃延伸8 min，4℃保存。PCR产物使用3.5%的琼脂糖凝胶电泳，或者聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法见附录三。从 HiDRAS 网站 （http：//www.hidras.unimi.it/） 和 GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank） 网站下载了 300 对均匀分布于苹果17条染色体上的已发表的 SSR 引物，在亲本及抗感池中进行初步筛选，选出在抗亲、抗池与感亲、感池中有多态性条带的引物，然后在207个做图群体上进行筛选。最终选出与抗性基因位点连锁的标记，根据所筛选出的SSR标记的已知信息，确定其所在的染色体，然后将 SSR 标记序列与苹果基因组数据库 （http：//www.rosaceae.org） 进行BLAST比对，将其定位在染色体的具体位置上。初步定位后，从网站 https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus x domestica/下载与目标基因位点连锁的 SSR 标记间的 contigs序列，根据SSR标记设计的方法，设计了 276 对新引物。这些引物首先在抗亲、抗池与感亲、感池中进行筛选，将产生多态性条带的引物再进行群体验证。对检测群体中各单株的 SSR 标记基因型分别赋值并记录，与抗池带型相同的记为 “A”，与感池带型相同的记为 “B”。将这些SSR标记在群体上的基因型数据进行孟德尔1R∶1S遗传符合度的卡方检验。并将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合，采用 JoinMap 4.0软件，对标记及抗性基因 R gls位点的连锁关系进行分析。利用软件中的Kosambi函数功能将重组率转化为遗传距离，其他参数设置为默认值。将筛选获得的与抗性基因 R gls位点最近的两个 SSR 标记，在两个亲本上进行PCR扩增。将差异片段进行胶回收。回收产物连接到载体pMD-19T simple，然后转化到大肠杆菌进行扩繁。将菌液PCR检测为阳性的克隆送生工生物工程 （上海） 股份有限公司测序。每个样挑取3个单菌落作为测序重复。测序结果用 DNAMAN 软件进行比对分析。具体操作方法见附录四。用CTAB法提取的苹果叶片基因组 DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，DNA条带清晰，完整无降解 （附图3-1）。可以用于后续的研究。从 HiDRAS 网站 （http：//www.hidras.unimi.it/） 下载的 300 对均匀分布于苹果17条染色体上的已发表的 SSR 引物在亲本及抗感池中进行初步筛选，选出54 对在抗亲、抗池与感亲、感池中有多态性条带的引物。再将这54 对引物用于作图群体的207 个单株以筛选与抗性基因位点连锁的 DNA 标记。最终筛选出2 个可以清晰区分抗感双亲、抗感池和杂交群体抗感单株的 DNA 标记，CH01d08 和CH05g05。引物序列如表3-1中所示，因为这两个标记已被报道位于苹果15号连锁群上 （Liebhard et al.，2002），所以将苹果炭疽菌叶枯病抗性基因 （命名为Rgls） 位点定位于15号连锁群上。连锁分析表明这两个标记分别位于Rgls基因位点两侧，通过 BLAST算法与苹果基因组数据库 （http：//www.rosaceae.org） 进行比对，SSR 标记 CH01d08位于15 号染色体的 Contig MDC021953.346 上，标记 CH05g05 位于MDC016699.237 上，物理位置分别位于染色体的 2343 kb 和13699 kb处，两个标记覆盖了染色体上11.3Mb区域 （表3-1）。根据苹果基因组 CH01d08 和 CH05g05 标记之间的核苷酸序列，自行设计了276对SSR引物。按照上述方法进行筛选，最终筛选出9对引物能够扩增出清晰稳定的多态性条带的引物 （附图3-2、附图3-3），分别为 S0607039、S0607001、S0506206、S0506001、S0506078、S0405195、S0405127、S0304673、S0304011 （表3-1）。连锁分析表明，标记S0405127和S0304673与Rgls基因位点的距离最近，位于该基因两侧，分别存在2个、4个重组个体。通过对这11个SSR标记在做图群体上的基因分型比例分析，符合 1R∶1S 的理论比值， P 值大于0.05 （表3-2）。SSR编号引物序列重复基序产物长度/bp退火温度/℃位点CH01d08aF：5′-CTCCGCCGCTATAACACTTC-3′R：5′-TACTCTGGAGGGTATGTCAAAG-3′ag29056MDC021953.346chr15∶13688903..13699651CH05g05aF：5′-ATGGGTATTTGCCATTCTTGC-3′R：5′-CCTGAAGCAAGGGAAGTCATAC-3′ag14356.5MDC016699.237chr15∶2343805..2349433S0607039F：5′-AACGCACCGACCCATTTC-3′R：5′-CCAGCTCGCATAACCACC-3′ct18654MDC011529.272chr15∶6103161..6122652S0607001F：5′-ATGAAAGCGAGTCGGAGTG-3′R：5′-GGGGAGGGTTGGTGGTTA-3′caggtcaggt26956MDC004171.329chr15∶5986277..6005012S0506206F：5’-GCTGAGATTTCCCCCATT-3′R：5′-GCTGCGGACACTGCTTAG-3′ttggatgtg24354MDC007696.347chr15∶5714203..5748693S0506078F：5’-AGAAAGGCCCTCAAACAG-3′R：5′-CTGCAGAAGGTGGGTATG-3′aaaagc30455MDC002692.183chr15∶5005415..5011924S0506001F：5′-CATGAAAAGGTAGGCAGTGG-3′R：5′-GAGGTTCTTGGGCAAGTGTT-3′acaaccaa30454MDC013564.245chr15∶5006247..5017709S0405195F：5′-AGACGGGCAAATTAGTTGAGAT-3′R：5′-TCCCTTCTATGATGAATGACACC-3′tg25853MDC016041.193chr15∶4672532..4691912S0405127F：5′-GGCACAATGTAGGAGGGATA-3′R：5′-GCTATGAGGAAATTGGCTCT-3′at33055MDC043871.6chr15∶4622388..4626535S0304673F：5′-GTTTGCACATTGTAATGCTG-3′R：5′-CAGTTTTCTAGTGATGTCGTTG-3′tg（ga）33353MDC013859.580chr15∶4121053..4135560表3-1 定位在15号连锁群上与Rgls基因连锁的SSR标记序列及引物SSR编号引物序列重复基序产物长度/bp退火温度/℃位点S0304011F：5′-GCCGAATCTGCGGAATTG-3′R：5′-TCCCACTTCCTCACCGTCTC-3′ag21056MDC015994.315chr15∶3183972..3196801表3-1 定位在15号连锁群上与Rgls基因连锁的SSR标记序列及引物（续）-1SSRmarkerObservedratio(R∶S)Expectedratio(R∶S)x2PS030401184∶123103.5∶103.53.670.06Ch05g0590∶117103.5∶103.51.760.18S030467393∶114103.5∶103.51.070.30S040512791∶116103.5∶103.51.510.22S040519588∶119103.5∶103.52.320.13S050607894∶113103.5∶103.50.870.35S050600192∶115103.5∶103.51.280.26S060700188∶119103.5∶103.52.320.13S060703998∶109103.5∶103.50.290.59S050620695∶112103.5∶103.50.70.40Ch01d08104∶103103.5∶103.500.96表3-2 SSR标记在207株 ‘金冠’ב富士’ F1 群体中的分离将Rgls位点附近的11个SSR标记在 ‘金冠’ב富士’ 杂交组合F1 群体的207个单株上进行连锁分析。将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合采用 JoinMap ver.4.0软件计算出重组率和遗传距离如附图3-4 所示。连锁图谱上标记的顺序依次为 S0304011、CH05g05、S0405195、S0304673、S0405127、S0506078、S0506001、S0506206、S0607001、S0607039、CH01d08，重组率分别为：13.0%、8.7%、5.3%、1.9%、1.0%、6.8%、6.8%、7.2%、7.7%、8.7%、24.6%。遗传距离分别为15.4 cM、7.2 cM、3.1 cM、0.9 cM、0.5 cM、3.0 cM、4.8 cM、6.4 cM、8.2 cM、10.7 cM和33.8 cM。 Rgls基因被定位于 S0304673 和S0405127之间。距离目标基因最近的标记为 S0405127，在抗性基因Rgls位点与S0405127标记之间仅发现两个重组个体，遗传距离为0.5 cM。S0304673 的遗传距离为 0.9 cM。在 ‘Fiesta’בTotem’-15 （F×T） （Fernández-Fernández et al.，2008） 的遗传图谱中，SSR标记CH05g05与Ch01d08的遗传距离为33.7 cM，而在本研究中二者之间的遗传距离为41.0 cM （附图3-4）。为了确定抗性基因Rgls位点的物理位置，将11 个标记序列与金冠苹果染色体基因组序列 （http：//www.rosaceae.org） 进行 BLAST 比对，确定这些标记位于15号染色体上的2.3～13.6 Mb。 Rgls被定位于标记S0405127和S0304673之间，跨度为4.1～4.6 Mb，两标记间的物理距离为500 kb （附图3-5）。对S0304673 和 S0405127 进行测序分析。S0304673 标记能够在双亲中扩增出差异条带，而 S0405127 标记只在 ‘金冠’ 上扩增出一条带，所以对S0304673 标记在双亲中的扩增产物进行了测序，而只对S0405127标记在 “金冠” 上的扩增产物进行了测序 （附图 3-6、附图3-7）。测序结果表明，SSR标记 S0304673 和 S0405127 的扩增片段大小分别为333 bp和330 bp。标记S0304673在 ‘富士’ 中的扩增片段比在 ‘金冠’ 中的扩增片段存在三处8～10 bp的碱基缺失，分别是 CT-CAGTGTGT、AGAGAAAG、CTTCTTACTT，另外还存在着一处两个碱基差异和六处单碱基差异。在 ‘金冠’ 中的扩增片段与参考基因组序列比对发现，有两处单碱基的差异，分别为 A/T和 G/A的碱基变化。标记S0405127在 ‘金冠’ 中的扩增片段与参考基因组序列比对发现，除在参考基因组中有两未知碱基以外，其余完全一致。本次测序确定了参考基因组序列的两处未知碱基分别为G和A。集团分离分析法 （BSA法） 是分子标记研究中的最经典的研究方法之一。其最大的贡献在于能够快速、有效地检测到与目的基因相连锁的分子标记，能够在连锁图谱中标记稀疏区或末端寻找到新的标记，并以此作为侧翼标记 （flanking marker），为继续寻找更紧密的连锁标记、构建高分辨率的连锁群、物理图谱和进行基因的图位克隆奠定基础 （廖毅，2009）。其原理简单、操作方便，而且克服了许多物种没有或者难以创建近等基因系的限制，被广泛地应用于作物育种中。同时必须注意到，物种基因组大小对标记与目标基因连锁距离是有影响的，一般来说基因组大，多态性少的物种，获得与目标基因紧密连锁标记的可能性也比较小。BSA法所能检测到的分子标记与目标基因的可信遗传距离一般在 15～25 cM，所以此法并不是在每一物种上都能获得所需要的目的标记 （Mackay and Caligari，2000）。DNA池的质量对BSA法的检测效率也有很大的影响。所以在实验过程中一定要注意，一是保证DNA 的纯度和浓度。杂质会影响紫外光的吸收率，高浓度的 DNA 溶解不均匀。因此混池时，尽可能使用高纯度 DNA，并适当稀释，否则会影响分池的精确性。二是避免 DNA 池污染。DNA 污染的原因有多方面，包括基因重组率、本身的表型效应、性状鉴定误差、DNA 混合误差、PCR 效率不均等。我们可以通过减少PCR 循环次数、减少混池单株数、构建多池、重复实验等方法来降低实验误差，否则这些误差将会导致多态性被覆盖而找不到目标标记。随着分子生物学技术的快速发展，许多分子标记被成功的应用于控制农艺性状的重要基因的遗传定位及遗传图谱的构建。如 RAP D标记、RFLP 标记、SCAR 标记、CAPs 标记、SSR 标记、SNP 标记等。在这些标记中，SSR标记具有重复性好、可靠性高、共显性和适合自动化操作等优点，成为基因定位和遗传图谱构建的首选。而且，SSR标记广泛从布于整个基因组。据统计，大约有163426个 SSR 位点公布在苹果17条染色体上 （关玲等，2011）。苹果基因组序列的公布，使SSR标记的批量开发及相应引物的设计变的更加便捷 （Guan et al.，2011）。人们可以利用已有的 SSR标记对整个基因组进行筛查，快速的将目标基因所在区域进行锁定。然后在该区域查找SSR并设计合成新的引物，进一步缩小基因所在范围。在本研究中，576 个 SSR 标记，包括300对以前发表的标记和276 对新开发的标记被首次应用于抗炭疽菌叶枯病基因位点的定位。从300对已发表并定位的SSR标记中成功的获得了2 个与抗性基因 Rgls位点连锁的 SSR 标记，CH01d08和CH05g05。这两个标记被定位于 ‘Fiesta’בTotem’ 遗传图谱的第15条染色体上的基因组序列 MDC021953.346 和 MDC016699.237上，位于抗性基因 R gls位点的两侧。这一初步定位的结果为后续标记的开发提供了非常重要的信息，明确了 R gls基因所在的染色体及区域范围。随后9个位于CH01d08和CH05g05之间与Rgls位点连锁的新标记被开发出来。最近的标记与抗性基因 R gls位点间的遗传距离为0.5 cM。在前人的研究中，SSR标记 CH01d08 和 CH05g05 被定位在 ‘Fi-esta’בTotem’ 的遗传图谱中，遗传距离为 33.7 cM.而在本研究中，它们间的遗传距离为41.0 cM。这种类似的现象Paolo等 （2013）也报道过。他们在利用四个分离群体构建与柱型基因 Co位点紧密连锁的遗传图谱时发现，特定标记间的遗传距离会因不同群体，甚至同一群体不同群体大小而不同。这有可能是由于采样不同或遗传因素控制的局部的和全基因组的重组频率不同造成的 （Doligez et al.，2006；Vezzulli et al.，2008；Moriya et al.，2009）。理论上，标记在基因组上的遗传位置与物理位置应该是对应的。但是在本研究中发现，部分标记的遗传位置与物理位置并不是一一对应的。从附图3-4和附图3-5中可以看出，共有8个SSR标记的连锁图谱上的位置与在 ‘金冠’ 基因组序列中的物理位置是一致，另外3个标记，S0506078、S0405195 和 S0304011在遗传图谱上的位置与物理图谱上的位置不一致。这有可能是由于当前的苹果基因组重叠群序列产生装配错误，也有可能是苹果基因组中染色体结构的变异造成的。对引物S0405127 和 S0304673在亲本金冠的扩增片段进行测序发现，所测序列中有四处碱基与参考基因组存在差异。这四个差异碱基及上述的三个与理论顺序不符的标记有可能会纠正基因序列组装错误。在本研究中位于抗性基因 Rgls位点两侧的标记 S0405127 和S0304673间遗传距离与物理距离的对应关系显示，1.4 cM 对应着500 kb个碱基 （物理距离/遗传距离=357 kb/cM）。在对苹果抗黑星病基因Vf位点的分子标记遗传定位的研究结果中显示，每cM 的遗传距离对应423～857 kb的物理距离 （Patocchi et al.，1999）。而在对控制苹果柱型基因 Co位点的遗传定位研究中，每 cM 的遗传距离对应702 kb的物理距离 （Paolo B et al.，2013）。这与本研究中所得出的结论不相符。这有可能与研究材料的群体大小、DNA提取的纯度及表型鉴定的准确性有关。本研究中所利用的SSR标记，特别是新设计的276 对引物，有很大比例在亲本间能扩增出多态性条带，而在抗感池间无差异。虽然这部分标记与抗性基因 R gls不存在连锁关系，但仍可用于群体遗传图谱的构建，以及其他性状标记的筛选。在对PCR产物的检测中，使用了3.5%的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方式。采用3.5%的琼脂糖凝胶电泳条带清晰，分辨率高，可以清楚的显示差异条带，而且操作简单，电泳速度快，但是存在显示的条带少的缺点。而聚丙烯酰胺凝胶电泳产生的条带很多，分辨率极高，甚至能分离1 bp的碱基差别，但是制备和操作复杂。本试验主要采用3.5%的琼脂糖凝胶电泳，所以可能会导致一些引物因产生的多态性条带间差异小，没有显示出来而被淘汰。本研究首次开展了与抗炭疽病叶枯病基因 R gls位点紧密连锁的分子标记的筛选，并构建了第一张与抗性基因 R gls位点紧密连锁的分子标记遗传图谱。通过对207株 ‘金冠’ב富士’ 杂交组合F1 群体的验证，11个与Rgls位点连锁的标记将该基因定位在苹果基因组第15条染色体上，覆盖了49.2 cM的遗传距离，标记S0405127 和 S0304673分别位于抗性基因位点的两侧，遗传距离分别为 0.5 cM 和 0.9 cM，对应于 ‘金冠’ 苹果基因组的物理距离为500 kb。这两个标记可以应用于抗炭疽菌叶枯病分子标记辅助育种，在定植前对幼苗进行抗性筛选。这将会显著的降低苹果抗炭疽菌叶枯病育种的成本，缩短育种时间。本研究结果对深入开展抗炭疽菌叶枯病的遗传机理和分子机制研究有重要的意义，并为进一步的抗性基因的图位克隆和基因功能验证奠定基础。

猕猴桃果脯 （图8-1） 在制作过程中，技术要求比较高，要根据当地的具体情况采取具体措施，本书介绍的方法可为生产者提供参考。图8-1 猕猴桃果脯原料分选→清洗→去皮→切片→烫漂→糖渍→糖煮→干燥→整形→包装（1） 原料分选。选用八成半成熟的果实，果实要有一定的硬度，无病虫害、霉烂变质。（2） 清洗。用流动自来水将猕猴桃表面的泥沙及污物洗涤干净。（3） 去皮。用80～90℃的浓碱液浸泡30～60秒去皮，然后迅速用自来水冲洗掉果实上的残留皮屑和碱液，并用1%的盐酸溶液浸泡以中和残留的碱液。（4） 切片。将猕猴桃果实横切成厚度为5～6毫米的薄片，并浸入1%～2%的盐水中，以抑制氧化酶的活性。（5） 烫漂。将猕猴桃片在沸水中烫漂2分钟左右，以杀灭氧化酶活性，并迅速用自来水冷却。（6） 糖渍。沥干水分的猕猴桃片，用白砂糖糖渍20～24小时，砂糖用量为称猴桃片重的40%，砂糖在上、中、下层的分布比例为5 ∶ 3 ∶ 2。（7） 糖煮。取出糖渍好的猕猴桃片，沥干糖液，在糖液内加入砂糖，使含糖量达到65%左右，煮沸后加入糖渍过的猕猴桃片，再次煮沸25～30分钟。当糖液含糖量达到70%～75%时，取出果片沥干糖液。（8） 干燥。将糖煮过的果片，放在竹筛网 （或不锈钢丝网） 上，在55℃左右的烘房内干燥24小时左右。（9） 整形包装。干燥后的果脯片需压平，然后用玻璃纸或聚乙烯薄膜包装。用猕猴桃果实制果酱的利用率高达90%以上，果酱营养丰富，甜酸适度，有良好的开胃生津效果，极受消费者欢迎。（1） 感官指标。色泽呈黄绿色或黄褐色，有光泽，均匀一致。口感具有猕猴桃酱所特有的风味，无焦煳味，无异味。形态为蒸制酱体呈胶黏状，带种子，保持部分果块，置于水面上允许徐徐流散，不得分泌汁液，无糖结晶。不允许有杂质存在。（2） 物理生化指标。每罐净重允许公差±3%，但每批平均不低于标明的净重。总糖量不低于57%（按转化糖计），可溶性固形物不低于65%（按折光计）。（3） 微生物指标。无致病病菌及因微生物作用而引起的腐败征象。（4） 罐型。旋口玻璃瓶或铁罐。选果→清洗、消毒→去皮→破碎→软化→加糖浓缩→装罐、封罐→杀菌→冷却→擦罐入库→包装→贮运（1） 原料选择。加工果酱的猕猴桃果实要求果心较小，种子较少，含有丰富的果胶物质和有机酸，果肉甜酸适度，芳香味浓，颜色一致，成熟良好。果肉颜色不同的果实，应分别进行加工。要剔除腐烂变质果、硬果及成熟过度果。（2） 原料清洗。先用1%的漂白粉溶液或0.1%的高锰酸钾溶液进行消毒处理，再用清水彻底清洗。（3） 去皮。可用人工法将果实切开，用勺子将果肉挖出；也可用化学去皮法，将10%～25%的氢氧化钠溶液煮沸，放入洗净的果实，浸泡1～2分钟，冲洗去皮以后再放入1%的盐酸溶液中，常温下处理30秒，立即用流水冲洗10分钟。（4） 打浆软化或破碎软化。①打浆软化是将果实去皮后，倒入打浆机中进行打浆。打浆机的筛板应根据留籽或去籽的加工要求进行选择。将果浆倒入夹层锅中，再加入75%的糖浆进行软化 （10～15分钟），这样可制成全泥状果酱。②破碎软化是将洗净去皮的果实，用破碎机破碎成小碎块，然后倒入夹层锅中加入糖液软化，这样可制成块状果酱。（5） 浓缩。浓缩包括常压浓缩和真空浓缩两种方法。常压浓缩是把果酱倒入夹层锅后，再加适量75%的糖液 （须先经过滤），然后加热，并不断搅拌，以便加速蒸发和避免发生焦糊。浓缩时蒸汽压力为245～294千帕，浓缩时间为30分钟左右。浓缩时间过长，易使果酱颜色变褐，凝胶能力降低，贮藏期蔗糖返沙。在有条件的厂中，可将原料用泵打入真空浓缩锅内，在减压低温条件下进行蒸发浓缩，能有效地避免养分的损失。为了提高果酱的质量，可添加适量的果胶，使色泽和风味有所提高。真空浓缩的配料为：果酱100千克、白糖100千克或75%的糖水135千克、真空浓缩锅的真空度约80千帕 （600毫米汞柱），浓缩到65%～66%（用折光计测） 出锅，再加热到100℃左右，以后保温在90℃以上。（6） 装罐。用经消毒的四旋瓶装酱，酱温不能低于86.5℃，趁热封罐，注意勿外溅污染瓶口。（7） 杀菌及冷却。玻璃瓶封口后应在100℃条件下立即杀菌20分钟，分段冷却，以防玻璃瓶炸裂。（8） 擦罐、入库。将杀菌后的玻璃瓶擦净入库。猕猴桃果汁是极受市场欢迎的保健饮料，用猕猴桃果汁还可以加工浓缩果汁、果酒、汽水、果冻、果晶等多种产品。（1） 感官指标。色泽呈黄绿色或浅黄色。口感具有猕猴桃汁特有的风味，酸甜适度，无异味。形态为汁液均匀混浊，静置后允许有沉淀，但摇动后仍呈均匀状态。不允许有杂质存在。（2） 物理生化指标。每罐净重为200克或250克，允许公差±3%，但每批平均不低于净重。可溶性固形物为11%～15%，总酸0.3%～1%（以柠檬酸计），原果汁含量不低于40%。（3） 微生物指标。无致病病菌及因微生物作用而引起的腐败征象。（4） 罐型。采用QB 221—1976马口铁罐型规格系列标准。选果→清洗、消毒→去皮→破碎、打浆→榨汁→过滤→调配→加热→装罐→封罐→杀菌→冷却→擦罐入库包装→贮运（1） 原料选择。要求果实成熟度达八九成，新鲜完好，色泽正常，无病虫果和烂果。（2） 原料清洗。先用1%漂白粉溶液或0.1%的高锰酸钾溶液进行消毒，清除虫卵及微生物，再用清水清洗几次。（3） 去皮。可用人工法将果实切开，用勺子将果肉挖出；也可用化学去皮法，将10%～25%的氢氧化钠溶液煮沸，放入洗净的果实，浸泡1～2分钟，冲洗去皮以后再放入1%的盐酸溶液中，常温下处理30秒，立即用流水冲洗10分钟。（4） 破碎、打浆。将去皮的果实在破碎机中破碎或在打浆机中打浆。（5） 榨汁。把破碎成浆的果实加热到60～65℃，放入榨汁机中榨汁 （立式压汁机），榨汁时如果在果浆中加入适量的果胶分解酶可使出汁率由55%提高到60%。（6） 过滤。在过滤机中过滤或用平板布过滤，把果汁中的残籽或果肉滤出。这时果汁混浊，若在低温下冷冻，吸取上清液便得到澄清果汁。若需制混浊果汁，则把滤出的混浊果汁在真空脱气罐中进行脱气，使果汁色泽不变，然后用高压均质机进行均质，使果汁中的细小颗粒进一步细碎，促使果汁溶出，使果胶与果汁亲和，保持果汁的混浊度。（7） 调配。按原果汁含量的40%加白砂糖配成可溶性固形物为35%以上的果汁。（8） 加热。将调配好的果汁通过灭菌器加热。（9） 装罐。当果汁温度在70～80℃时，应当迅速装入罐或瓶 （罐、瓶必须提前清洗干净和消毒）。（10） 封罐。趁热将罐封口，真空度要求46.7 千帕 （350毫米汞柱） 以上，要封口良好。（11） 杀菌及冷却。装罐密封后立即杀菌 8～15 分钟（100℃），杀菌后冷却到40℃时取出。（12） 擦罐、入库。冷却后将罐擦干净入库。原料选择→清洗→去皮→修整→预煮→装罐→排气→密封→杀菌→冷却→检验→贴标→成品（1） 原料选择与清洗处理。选用七八成熟、果实个体大小较均匀的中等果实为原料，剔除烂果、过大过小果、病虫果、机械伤及畸形果。品种以老皮绿肉为好，用清水清洗干净，晾干备用。（2） 去皮、修整。将清洗干净的果实投入煮沸的烧碱溶液（10%～15%） 中浸泡2～3分钟，待果皮由黄褐变黑并产生裂缝时，用笊篱捞出。戴上橡皮手套，用双手轻轻搓去果皮，然后置于清水中不断清洗，除去碱味。用不锈钢刀挖去花萼、果蒂，去除残余果皮及斑疤，并按色泽和大小分级。（3） 预煮。将去皮修整后的果肉放在沸水中预煮3～4 分钟，捞出后迅速冷却。（4） 糖水配制。65升清水加35千克白糖，加热煮沸后用绒布或4层纱布过滤。用柠檬酸调 pH 值为4，糖水温度保持在80℃以上。糖水随用随配，不得积压。（5） 装罐。选色泽一致、大小均匀的果块装罐，然后加入糖水，罐内留2～3毫米的顶隙，罐盖与胶圈须用100℃热水烫煮消毒 5 分钟。装罐后，放入排气箱内进行排气，蒸汽温度98～100℃，排气10～12分钟，至罐中心温度达到80℃以上时封盖。如无排气箱，也可用蒸锅代替。排气温度和排气时间要妥善掌握。封盖后立即杀菌，即5分钟内使杀菌锅内的温度上升到100℃，并在此条件下保持18分钟。猕猴桃果酒，是一种低度酒，一般酒精度为12°左右，较甜，具有猕猴桃特有的果香和醇香，是老少皆宜的产品。选果→清洗、消毒→破碎→主发酵→压榨分离→后发酵→陈酿→调配→过滤→装瓶→成品（1） 原料选择。原料需要充分成熟发软且有猕猴桃浓香味的果实，剔除腐烂变质、病虫果及未熟果。（2） 清洗。用清水洗去果实上的泥沙、虫卵及其他杂质。（3） 破碎。将洗净的果实在破碎机内破碎成浆状或糊状。（4） 主发酵。把已破碎的果浆，倒入或泵入经过消毒的发酵池或缸内，加入5%的酒母糖液，搅拌均匀，发酵温度维持在25～28℃，每天搅拌2次 （上、下午各1次），使发酵均匀。当残糖下降到1%时，即可进行压榨分离。（5） 压榨。主发酵结束后进行压榨，使皮渣与酒液分离。压榨后的皮渣，还可进行2次发酵，蒸馏白酒或称 “白兰地”。（6） 后发酵。酒液转入后发酵，当酒度达到12°时，再加入适量砂糖，在20～25℃条件下，进行30天左右的后发酵，之后可转入陈酿。（7） 陈酿。后发酵结束后酒液不清，不容易沉淀，此时可将酒液倒入池或缸中，调整酒度到16°左右，置于15～18℃的室温下进行陈酿，翌年2月进行倒池或倒缸，年底即可调配成成品酒。（8） 调配过滤。调配酒度可按12°～16°调配，经过滤后，要求酒液透明。（9） 装瓶。将酒装入已经消毒好的瓶中，装后立即压盖密封。（10） 包装成品。通过检查质量合格的猕猴桃酒，贴上商标，作为成品销售。

主要包括桑白蚧和草履蚧，属半翅目。桑白蚧和草履蚧严重影响猕猴桃树的正常生长发育和花芽形成，削弱了猕猴桃树势 （图10-1）。图10-1 草履蚧雌成虫 （左） 与雄成虫 （右）（1） 桑白蚧。雌介壳圆形，直径2.0～2.5毫米，略隆起，壳点黄褐色，在介壳中央略偏；雄介壳细长，白色，长约1毫米。以若虫及雌成虫群集固着在枝干上吸食养分，严重时枝蔓上似挂了一层棉絮 （图10-2、 图10-3）。（2） 草履蚧。雌成虫长10毫米，褐色，被一层霜状蜡粉，体扁，呈草鞋底状；雄成虫，长5～6 毫米，翅淡紫黑色，半透明。图10-2 桑白蚧成虫图10-3 桑白蚧为害状（1） 桑白蚧。一年发生2～5 代。雌虫受精后在枝干上越冬，3月开始群居于枝干为害，5 月繁殖量增加，为害加重，7月达到为害最高峰，部分地区至12月仍有为害。（2） 草履蚧。每年发生1代，以卵在土中越夏和越冬；翌年1月下旬至2月上旬，开始在土中孵化，孵化期要延续1个多月。若虫出土后沿茎上爬至梢部、芽腋或初展新叶的叶腋刺吸为害。5月羽化为成虫，交配后，雌成虫潜入土中产卵。（1） 植物检疫。防止苗木、接穗带虫传播蔓延。（2） 农业防治。剪除病虫枝，改善通风透光条件；加强果园田间管理，促进果树枝条健壮生长，恢复和增强树势。在草履蚧雄虫化蛹期、雌虫产卵期，清除附近墙面虫体。（3） 生物防治。注意保护及利用天敌，如红点唇瓢虫及日本方头甲等。在5—6月天敌发生盛期，使用对天敌安全的低毒杀虫剂。（4） 化学防治。①休眠期防治。春季萌芽前喷5%柴油乳剂、95%溶敌机油乳剂50倍液、5波美度石硫合剂。②生长期防治。桑白蚧若虫分散转移期 （5月下旬、7月中旬） 25%噻嗪酮可湿性粉剂1000倍液、12.5%氰戊·喹硫磷乳油1000倍液、38%吡虫·噻嗪酮悬浮剂1500倍液、25%噻虫嗪水分散粒剂4000倍液。杀虫剂应交替施用，每个孵化盛期 （若虫分散转移期） 是药剂防治的关键时期。连喷2～3次药，可有效防止桑白蚧的发生蔓延。在草履蚧孵化始期后 40 天左右喷药，药剂选择参照桑白蚧。叶蝉是半翅目叶蝉科害虫的总称，俗称浮尘子。在猕猴桃上为害的叶蝉种类有桃一点斑叶蝉、小绿叶蝉 （图10-4、 图10-5）、大青叶蝉、黑尾叶蝉、葡萄斑叶蝉等。图10-4 小绿叶蝉成虫图10-5 小绿叶蝉若虫叶蝉体小，体长3～12 毫米，外形似蝉，后腿胫节有刺2列，善跳跃，有 “横走” 的习性。成虫、若虫刺吸植物汁液为害，叶片被害后出现淡白色斑点，而后点连成片，直至全叶苍白枯死。叶蝉通常以成虫或卵越冬。越冬卵产在寄主组织内。成虫蛰伏于植物枝叶丛间、树皮缝隙里。3 月中下旬，叶蝉开始活动。6月中旬至7月中旬为第一次高峰，9月上旬开始至11月上旬，为第二次高峰，11月中旬以后，叶蝉开始越冬。成虫、若虫均善走能跳，成虫且可飞行迁徙，具有趋光习性。（1） 农业防治。冬季清除杂草和枯枝落叶，集中烧毁，以压低越冬虫口密度。（2） 物理防治。黑光灯诱杀成虫，可降低下一代虫口发生的基数。（3） 生物防治。保护和利用天敌，如蜘蛛、华姬猎蝽、寄生蜂、小枕异绒螨等。（4） 药剂防治。各代若虫盛发期是化学防治的关键时期。可喷施10%吡虫啉可湿性粉剂1500倍液、5%啶虫脒乳油2000倍液、25%噻嗪酮可湿性粉剂1000倍液、25%噻虫嗪水分散粒剂4000倍液、0.5%印楝素乳油2000倍液、40%联苯·噻虫啉悬浮剂2000倍液、50%烯啶虫胺可溶液剂2500倍液、50%吡蚜酮水分散粒剂2500倍液、25%丁醚脲悬浮剂5000倍液。周边的杂草和草坪也要注意喷药兼治。吸果夜蛾属鳞翅目夜蛾科害虫，主要以刺吸果实汁液为害。猕猴桃上的吸果夜蛾以嘴壶夜蛾、鸟嘴壶夜蛾和枯叶夜蛾为主。（1） 嘴壶夜蛾。成虫体长18毫米，翅展34～40毫米，头部棕红色，腹部背面灰白色。老熟幼虫长44 毫米左右，漆黑色（图10-6、 图10-7）。（2） 鸟嘴壶夜蛾。成虫体长23～26 毫米，翅展49～51 毫米，头部及前胸赤橙色，中、后胸褐色。前翅紫褐色。老熟幼虫体长约46毫米，灰黄色 （图10-8、 图10-9）。（3） 枯叶夜蛾。成虫体长35～42 毫米，翅展约100 毫米，前翅灰褐色，后翅黄色。老熟幼虫长60～70毫米，紫红色或灰褐色 （图10-10）。当果实近成熟期，吸果夜蛾成虫用口器刺破猕猴桃果皮而吮吸果汁。刺孔很小难以察觉，约1 周后，刺孔处果皮变黄、凹陷并流出胶液，其后伤口附近软腐，并逐渐扩大为椭圆形水渍状的斑块，最后整个果实腐烂。图10-6 嘴壶夜蛾幼虫图10-7 嘴壶夜蛾成虫图10-8 鸟嘴壶夜蛾幼虫图10-9 鸟嘴壶夜蛾成虫图10-10 枯叶夜蛾吸果夜蛾1年发生3～4代，以幼虫或成虫越冬。发生时期从5月下旬至11月中旬，为害高峰期主要在6月中下旬、8月中下旬、9月中旬至10 月中旬。主要以第3 代成虫为害猕猴桃果实。（1） 搞好清园。将果园及其四周的木防己、汉防己等杂草连根铲除。（2） 果实套袋。从幼果期始对猕猴桃果进行套袋。（3） 诱杀成虫。利用黑光灯进行诱杀；用8%糖和1%醋的水溶液加0.2%氟化钠配成诱杀液，挂瓶诱杀。（4） 拒避成虫。在每10亩猕猴桃园中，设40瓦金黄色荧光灯6盏，能减轻吸果夜蛾为害。金龟子是杂食性害虫，属鞘翅目金龟科。幼虫俗称 “蛴螬”（图10-11），是猕猴桃生产中的重要害虫，在我国猕猴桃产区发生普遍，在山地果园普遍受害较严重。为害嫩叶、嫩芽。主要有白星花金龟、苹毛丽金龟、铜绿丽金龟、黑绒鳃金龟。（1） 白星花金龟。成虫体长16～24毫米，楠圆形，全身黑铜色，带有绿色或紫色金属光泽，体表散布众多不规则白绒斑。幼虫体长24～39毫米，头部褐色，胸足3对，身体向腹面弯曲呈 “C” 字形 （图10-12）。（2） 苹毛丽金龟。成虫体长约10毫米，卵圆或长卵圆形。头胸部古铜色、有金属光泽，鞘翅半透明、茶褐色、鞘翅上有纵列成行的细小点刻 （图10-13）。幼虫体长约15毫米，头黄褐色，胸腹部乳白色各节皆有横皱纹，无腹足。图10-11 蛴螬图10-12 白星花金龟图10-13 苹毛丽金龟（3） 铜绿丽金龟。成虫体长约20毫米，长椭圆形，全身背面为铜绿色，有金属光泽。幼虫体长约30毫米，除头部为黄褐色，其余均为乳白色，身体向腹面弯曲呈 “C” 字形。（4） 黑绒鳃金龟。成虫体长8～9 毫米，卵圆形，全身黑色，密披绒毛，有一定的金属光泽。幼虫体长约15毫米，头部黄褐色，胸部乳白色，腹部末节腹面有刺。金龟子自4月下旬至5月上旬开始转移到猕猴桃园中为害嫩枝、细叶和花蕾，5月下旬至6月上旬、7月下旬至8月中旬出现两个为害高峰，9月以后数量极少。金龟子大多种类有昼伏夜出的为害习性。（1） 农业防治。秋末深翻土地，消灭部分越冬幼虫和成虫，并进行人工捕捉。（2） 物理防治。利用金龟子的假死性和趋光性，进行振落捕杀，频振灯诱杀。（3） 化学防治。①蛴螬防治。每公顷用5%辛硫磷颗粒剂30～40千克0.5%阿维菌素颗粒剂30～40千克，拌细土撒施。②成虫防治。最好的防治期在4月出土时和5—7月，可用50%马拉硫磷乳剂1000～1500倍液喷雾。成虫上树为害期，可用溴氰菊酯喷施防治。猕猴桃透翅蛾属鳞翅目透翅蛾科。中国已知有40余种。猕猴桃透翅蛾双翅狭窄。翅面被稀疏鱗片。喜在白天飞翔，夜间静息。以幼虫蛀食枝蔓内部为害。从蛀孔处排出褐色粪便，被害处膨大肿胀似瘤，叶片变质，果实脱落，最后造成枝蔓死亡 （图10-14）。图10-14 猕猴桃透翅蛾幼虫蛀茎猕猴桃透翅蛾一般1年发生1代，以老熟幼虫在粗枝内越冬，3月起在被害茎干内侧化蛹，4—5月羽化为成虫。成虫将卵产在当年生枝条叶腋或嫩梢上。幼虫孵化后从叶柄茎部蛀入嫩梢中的髓部向下蛀食，形成孔道，被害处上方嫩梢常枯萎或折断，嫩枝食空后，幼虫向下转移到老枝中继续为害，被害老枝常膨大如瘤状，茎干上有虫孔，常堆积大量虫粪。管理粗放，果树生长不良的果园受害严重。成虫羽化产卵期和幼虫孵化初期，对树干1米以下的老树皮、旧羽化孔、被害部位等产卵场所进行刮皮，收集刮下来的树皮、碎屑并集中烧毁，消灭其中的虫卵和初孵出的幼虫；在羽化盛期设置黑光灯诱集成虫；用性诱剂诱杀雄虫。苹小卷叶蛾属鳞翅目卷叶蛾科。成虫体长6～8 毫米，翅展15～20 毫米，黄褐色 （图10-15）。卵扁平，椭圆形，淡黄色 （图10-16）。初孵幼虫淡绿色（图10-17），老熟幼虫翠绿色，体长13～18毫米，头上黄白色，胸足均是淡黄色。蛹呈黄褐色，长9～11毫米 （图10-18）。一般为害猕猴桃嫩叶、花蕾、果实等。图10-15 苹小卷叶蛾成虫图10-16 苹小卷叶蛾卵图10-17 苹小卷叶蛾幼虫图10-18 苹小卷叶蛾为害果实1年发生3～4代，以二龄幼虫在树干皮下，枯枝落叶上结茧越冬，春天孵化后幼虫主要为害幼芽、嫩叶、花蕾和果实，9—10月作茧。（1） 农业防治。消灭越冬幼虫，摘除叶虫苞烧毁。（2） 生物防治。用松毛虫、赤眼蜂等天敌进行防治。（3） 化学防治。在孵化期喷洒80%敌敌畏乳油400～500毫克/千克。斑衣蜡蝉属半翅目害虫。成虫体长14～15毫米，翅展40～55毫米，体小，短而宽，全体披有白色蜡粉，前翅基部2/3为淡灰褐色，有黑点，端部1/3为黑色，后翅臀区1/3鲜红色，中部白色，有7～8个黑点，端部黑色并有蓝色纵纹，头呈三角形向上翅起。若虫体扁平，初龄若虫黑色有白点，末龄若虫红色有黑斑 （图10-19、 图10-20）。以成虫、若虫刺吸为害猕猴桃的嫩叶、嫩枝干，排泄出的粪便可造成叶面、果面污染，可造成树体衰弱、树皮枯裂、甚至树体死亡。1年发生1代，以卵越冬，翌年4—5月孵化，若虫常群集在果树的幼枝和嫩叶背面取食为害，若虫期约40天，经过4次蜕皮变为成虫。成虫和若虫后腿强劲发达，跳跃自如，爬行较快，可加速躲避人的捕捉。7—8月是为害果树的高峰期，雌雄虫交尾后，雌虫多将卵块产在树干与枝条分叉的背阴下面，卵块表面外附一层粉状蜡质保护膜。图10-19 斑衣蜡蝉成虫图10-20 斑衣蜡蝉幼虫（1） 农业防治。春冬修剪剪除虫枝，铲除卵块。（2） 化学防治。6—8月，全园喷布氯氟氰菊酯，10～15天喷布一次，杀灭成虫。蝽属半翅目。体形一般为椭圆形或长椭圆形，且略带扁平。口器刺吸式，为害寄主植物的茎叶或果实。其若虫、成虫均能造成为害。被害叶片和嫩茎出现黄褐色斑点，导致叶片提早脱落。被害果实常变成畸形果，受害部位果肉硬化，品质变差。为害猕猴桃的蝽主要有菜蝽、麻皮蝽、二星蝽、广二星蝽、紫蓝曼蝽、稻棘缘蝽、斑须蝽 （图10-21） 和小长蝽等。（1） 菜蝽。菜蝽成虫体长6～9毫米，椭圆形，橙黄或橙红色，头黑色，翅的革质部分有橙黄或橙红和黑色相间的色块。足黄、黑相间。（2） 麻皮蝽。麻皮蝽的成虫虫体较大，黑色，密布黑色刻点和细碎的规则黄斑。若虫身体扁洋梨形，前端较窄，后端宽圆，全身侧缘具浅黄色狭边。（3） 二星蝽。体长4.5～5.6毫米，宽3.3～3.8毫米，背面有2个黄白光滑的小圆斑。图10-21 斑须蝽的若虫 （左） 与成虫 （右）（1） 菜蝽。1年发生1～2代，3月下旬开始活动，4月下旬交配产卵。5—9月是成虫与若虫的主要为害时期。具有微弱的趋光性，灯光下常可捕捉到。（2） 麻皮蝽。1年发生1～2代，发生2代的地区，越冬成虫3月下旬开始出现，4月下旬至7月中旬产卵，第1代若虫5月上旬至7月下旬开始为害；第2代7月下旬初至9月上旬开始为害。有弱趋光性和群集性。（3） 二星蝽。以成虫在杂草丛、枯枝、落叶间越冬。越冬成虫在3月下旬开始活动，4月中旬至5月中旬产卵。成虫和若虫均喜阴蔽，多栖息在嫩穗、嫩茎或浓密的叶丛间，遇惊吓即跌落在地面。成虫具有弱趋光性，可在黑光灯下诱捕。（1） 农业防治。及时清园，铲除杂草并烧毁，以减少越冬虫基数。对有群集习性的蝽，可在群集时捕捉杀死。（2） 化学防治。可采用50%杀螟硫磷乳油1000～2000倍液等药剂，喷洒防治。（3） 物理防治。利用蝽生活习性上的某些弱点，采取相应措施防治。如对有明显假死的蝽，可于出蛰树初期，将其振落捕杀；或于树干上束草，诱集该虫入内越冬，然后将其烧死；对于有集中在树干皮缝中越冬的蝽，则可用刮除树皮或用硬刷刷死的方法进行防治。成虫体长1.2～1.5毫米，口器为咀嚼式，黑褐色或深红色。主要为害两个相邻果，受害后果面出现针尖大小的孔，果面表皮细胞形成木栓化凸起，受害后有明显小孔而表面下果肉坚硬，使口感变差，没有商品价值 （图10-22）。图10-22 猕猴桃东方小薪甲1年发生2代，5月下旬至6月上旬，是为害高峰期。7月中旬出现第2代成虫，此时对猕猴桃为害较轻。5月中旬当猕猴桃花开后及时防治，比往年提前10天，连续喷2次杀虫药，一般间隔10～15天1次。可临时性用5%高效氯氟氰菊酯3000倍液+柔水通4000倍液。猕猴桃红蜘蛛体形非常小，呈主要通过吸食叶片汁液或猕猴桃幼嫩组织为害 （图10-23）。受害叶片出现叶缘上卷，叶片褐黄失绿，最后枯黄脱落。为害严重时，叶片焦黄，树势变弱，果实膨大缓慢，形成次果，影响产量。图10-23 猕猴桃红蜘蛛猕猴桃红蜘蛛一年多代，一般的从2月中旬开始活动，6月中下旬开始为害，7月中下旬，高温干旱时是为害的高峰期，到8月下旬至9月初，为害逐渐减轻。环境温度低于26℃，猕猴桃红蜘蛛的繁殖会受到抑制，10月底开始越冬。（1） 农业防治。加强园内水肥管理，增强树势，提高果树抵抗病虫害的能力、注意冬季清园。（2） 化学防治。在6—8月连续喷药防治2～3次，在6月中旬虫情始发期或发生之前，进行第一次喷药。7月上中旬虫情爆发期进行第二次喷药，8月上旬进行巩固性第三次喷药。冬季全园全株喷施3～5 波美度石硫合剂或其他代用品，达到病、虫、卵并杀的目的。桑毛虫，别名金毛虫、桑斑褐毒蛾、纹白毒蛾。鳞翅目害虫。成虫白色，体长14～18毫米，翅展36～40毫米。幼虫体长26～40毫米，头黑褐色，体黄色 （图 10-24）。幼虫食害芽、叶，将叶食成缺刻或孔洞，甚至食光，仅留叶脉。1年发生2代，以三龄幼虫在枝干缝隙、落叶中结茧越冬。翌年春天，果树发芽时越冬幼虫破茧而出，为害嫩芽和叶片，5月中旬开始老熟后结茧化蛹，6月上旬羽化，成虫有趋光性，卵产于叶背或枝干上，初孵幼虫群集叶背，取食叶肉，三龄后分散为害叶片，7月下旬至8月上旬羽化为第1代成虫，交尾产卵繁殖第2代幼虫，幼虫为害至10月，以三龄幼虫寻找适宜场所越冬。图10-24 桑毛虫幼虫（1） 农业防治。秋季越冬前，在树干上束草，诱集越冬幼虫，冬后出蜇前把草取下，同时采除枝干上的虫茧，放入寄生蜂保护器中，待天敌羽化后，再把草束烧毁。及时摘除卵块，摘除群集幼虫。（2） 化学防治。于幼虫发生期树上施药。猕猴桃蝙蝠蛾属鳞翅目蝙蝠蛾科，为蛀干性害虫。成虫体长32～36毫米，翅展69～74毫米，体灰褐色；头胸密生灰褐色毛，前翅外边缘有5个枯叶斑，3个黄斑。老熟幼虫体长60～73毫米。头和前胸黑褐色 （图10-25），受惊后吐出黑褐色的黏液。以幼虫钻蛀枝干为害。图10-25 猕猴桃蝙蝠蛾幼虫两年发生1代，9月底至10月初，以卵在地面草丛中或幼虫在树干蛀道内越冬。翌年4月下旬至5月上旬孵化，6月上旬至9月下旬为幼虫为害盛期，第三年4月中旬至5月上旬开始化蛹，成虫于5月出现。（1） 农业防治。结合修剪，剪除带虫枝蔓并烧毁。（2） 物理防治。5月雨季后，成虫大量羽化期，到受害猕猴桃蛀孔附近去捕捉成虫；5月上旬之前有新粪排出，判断蛀食部位后，用铁丝刺杀幼虫、蛹。（3） 化学防治。用棉球蘸敌敌畏、氯氰菊酯药液塞入虫道内，并密封虫道，杀死幼虫。鳞翅目害虫，又名莲纹夜蛾，俗称夜盗虫、乌头虫等。成虫体长14～20毫米，翅展35～46毫米，体暗褐色，前翅灰褐色，花纹多，翅中间有明显的白色斜带纹 （图10-26）；幼虫体长33～50毫米，头部黑褐色，胸部颜色多变，背面各节有近似三角形的半月黑斑1对。以幼虫咬食叶片、花及果实为害。图10-26 斜纹夜蛾1年发生4～8代，初孵幼虫具有群集为害的习性，三龄以后则开始分散，老龄幼虫有昼伏性和假死性。成虫具有趋光性和趋化性。（1） 农业防治。清除杂草，破坏化蛹场所，减少虫源；摘除卵块和群集为害的初孵幼虫。（2） 物理防治。成虫发生期，用黑光灯、糖醋毒液诱杀成虫。（3） 化学防治。幼虫发生期，喷施25%马拉硫磷1000倍液2～3次，每隔7～10天喷施1次，喷匀喷足。广翅蜡蝉属于半翅目害虫。为害猕猴桃的种类很多，主要包括八点广翅蜡蝉 （图 10-27）、柿广翅蜡蝉和眼纹广翅蜡蝉等。多数广翅蜡蝉在形态上都相似。成虫体长7～15毫米，翅宽阔，不同的种类翅上的斑纹不同。若虫体宽胖、菱形，腹部末端多有各种形态的蜡丝。以成虫和若虫吸取幼嫩部分汁液为害，成虫产卵也会导致枯枝。图10-27 八点广翅蜡蝉八点广翅蜡蝉1年发生1代，以卵于枝条内越冬。5月间陆续孵化，7月下旬开始老熟羽化，8月中旬前后为羽化盛期。8月下旬至10 月下旬为产卵期。成虫产卵于当年发生枝木质部内，以直径4～5毫米粗的枝背面光滑处落卵较多，产卵孔排成1纵列，孔外带出部分木丝并覆有白色棉毛状蜡丝，极易发现与识别。（1） 农业防治。冬剪时，剪除有卵块的枝条集中处理，减少虫源。（2） 化学防治。可喷施菊酯类及其复配药剂等，均有较好效果。

沃尔巴克氏体（Wolbachia）是自然界中分布非常广泛的胞内共生菌之一，近10余年的研究表明，这类共生菌广泛存在于各类昆虫体内，甚至估计16%的昆虫均含有该菌[1]。对来自33个不同寄主的38个不同Wolbachia株系的ftsZ基因（细胞周期基因）研究表明，Wolbachia 株系间存在着很大的差异，Wolbachia 株系分为A组群和B组群[2]。Zhou等在wsp（编码Wolbachia表面蛋白）基因序列分析的基础上，将沃尔巴克氏体细分为12个亚群（Subgroup），并设计了12个亚群wsp基因诊断的PCR扩增特异引物[2]。昆虫体内是否含有Wolbachia，早期多通过DAPI染色法（用非特异性的DNA-blinding荧光染料DAPI染色，然后在荧光显微镜下观察）[4]和电镜观察[5]来判断，但20世纪90年代以来则主要依赖于对其16S rDNA、23S rDNA、ftsZ 和wsp等基因进行PCR检测与序列分析，其中wsp基因是目前报道的Wolbachia基因中进化最快的基因而被广泛用于Wolbachia的PCR检测与分子鉴别[1，3，6，7]。沃尔巴克氏体通过卵的细胞质传播并参与多种调控其寄主生殖活动的机制，包括诱导孤雌生殖（Parthenogenesis inducing，PI）[8]、雌性化Feminzation）[9]和生殖不亲和[10]，因而它很有希望被用于许多虫媒传播的重大人类疾病的基因工程防治和生物防治。灰飞虱（Laodelphax striatellus Falln）广泛分布于东亚、东南亚、欧洲和北非等地，我国以长江中下游和华北地区发生较多。灰飞虱能取食或为害水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、稗草、李氏禾等多种禾本科植物，并且能传播多种病毒病，造成病害的普遍流行。因此，进行灰飞虱种群暴发成灾规律及其有效防治技术的研究，显得尤其重要和紧迫。本文采用PCR方法研究了灰飞虱体内Wolbachia的感染，以期为开辟控制灰飞虱暴发和阻断病毒病传播新途径提供依据。从河北省曲阳和容城小麦田采集灰飞虱成虫，保存在小麦苗上。每只灰飞虱为1个样本，放入离心管中冷冻，而后置于载玻片上，呈直线逐步滴1滴Ringer's solution（昆虫生理盐水），去头，放入装有预冷100μl STE 的管中，匀浆，10%SDS 5μl及蛋白酶K 2.5μl，55℃水浴1h，加酚50μl及50μl氯仿：异戊醇（24：1），剧烈震荡，12000r/min 离心5min。取上清，加入2倍体积无水乙醇及0.1体积3mol/L NaAc，-20℃沉淀过夜，离心，12000r/min。弃上清，加75%乙醇200μl洗涤2遍。55℃烘干，加入30μl无菌水溶解，-20℃冻存，待检。扩增wsp基因片段使用的引物[3]：wsp 81F(5'TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC3')wsp 691R(5'AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3').在20μl反应体积中进行PCR反应，反应体系为13.5μl ddH2O，2μl 10×Buffer，2μl 25 mmol/L MgCl2，0.5μl dNTPs（每种10mmol/L），0.5μl 20μmol/L的正向和反向引物及一个单位的Taq高温多聚酶。Taq plus及dNTP购自上海生工生物工程公司。PCR反应条件是：首先在94℃下变性3min，然后94℃下1min，55℃下1min，72℃下1min完成1个循环，共进行35次循环。72℃末轮聚合10min。反应结束后取PCR特异性扩增产物5μl，在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳（电压40V，50min，电泳缓冲液为0.5×TBE），用BioRad凝胶成像系统检测并拍照。选择有扩增产物的样品进行大量PCR扩增，采用PCR产物回收试剂盒（上海生工生物公司产品）回收PCR扩增产物交上海生工生物工程公司进行测序，利用BLAST工具（NCBI网站）进行DNA序列检索和同源性比较。采用wsp基因通用引物81F和691R对灰飞虱DNA样品进行PCR扩增，电泳检测结果表明从灰飞虱DNA样品中可扩增出600bp大小的wsp目的基因片段，证实河北曲阳和容城田间采集的灰飞虱种群有Wolbachia 的感染（图1）。河北曲阳和容城灰飞虱种群的沃尔巴克氏体感染率分别为85.6%和88.4%，而且雌雄个体感染率无差别。将扩增的wsp基因片段进行基因序列测定，结果表明，从所检测的样品中扩增出的Wolbachia的wsp基因片段长度为601～603bp。用NCBI网站提供的BLAST分析工具进行基因序列同源性分析，表明灰飞虱体内感染的Wolbachia wsp基因与Wolbachia pipientis 的wFur、wStri 2个品系的wsp基因的同源性为100%，与Wolbachia sp.的wJapo、wFur、wStri 3个品系的wsp基因的同源性也达到100%（表1）。图1 灰飞虱体内沃尔巴克氏体wsp基因片段的扩增Wolbachia品系同源性注册号宿主来源WolbachiapipientisisolatewFur100%AF481185.1白背飞虱Kittayapong等，2003WolbachiapipientisisolatewStri100%AF481175.1灰飞虱Kittayapong等，2003Wolbachiasp.Wstri100%AF020080.1灰飞虱Zhou等，1998Wolbachiasp.wJapo100%AB039283.1ElenchusjaponicusNoda等，2001Wolbachiasp.wFur100%AB039043.1白背飞虱Noda等，2001Wolbachiasp.Wstri100%AB039042.1灰飞虱Noda等，2001表1 灰飞虱感染Wolbachia的wsp基因序列的同源性Wolbachia是自然界分布较广的共生菌，在双翅目、膜翅目和鳞翅目等许多昆虫体内均有感染。甘波谊等以PCR方法检测了来自不同地域稻田的3种稻飞虱，发现灰飞虱、褐飞虱（Nilaparvata lugens）、白背飞虱（Sogatella furciera）均被Wolbachia所感染，对wsp的RFLP分析证实了这些飞虱为单一沃尔巴克氏体感染[11]。但不同地区灰飞虱体内沃尔巴克氏体的感染率不同，在我国形成了周边地区感染率高（如辽宁、北京、上海和云南），而内陆地区感染率低（如四川），或是未被感染（如宁夏）的格局[11]。在日本采集的9个灰飞虱种群被Wolbachia感染的比率随纬度降低而增加[12]。这些不同可能与不同地区的地形、气候、寄主条件及Wolbachia的传播效率等因素有关，其原因有待研究证实。本文研究结果表明，河北曲阳和容城灰飞虱种群沃尔巴克氏体感染率较高，与前人的报道一致。通过对基因序列的同源性分析表明，河北的2个灰飞虱种群感染的Wolbachia与来自白背飞虱的wFur品系、灰飞虱的wStri品系亲缘关系较近，同属于Wolbachia B大组Con组。这些表明灰飞虱可能会被同一组的Wolbachia感染。灰飞虱是多种病毒的传播介体，灰飞虱的暴发流行常造成玉米粗缩病、水稻条纹叶枯病等病毒病的严重流行。沃尔巴克氏体是灰飞虱的胞内共生菌，能够通过多种机制调控其寄主的生殖活动[13]，但是，近年灰飞虱种群暴发成灾与Wolbachia 感染的关系有待进一步研究证实。同时，沃尔巴克氏体影响灰飞虱传毒能力的作用及利用媒介昆虫—共生菌技术阻断病毒的传播将是今后研究的重点，对于开辟病毒病防治新途径具有重要的意义。