根癌病是根癌土壤杆菌（Agrobactium spp.）引起的一种顽固性病害，此菌寄主范围广，可侵染93科331个属643个种的植物，包括果树、林木、花卉等多种双子叶植物和部分裸子植物，在生产上造成非常大的损失。调查表明在我国多数种植根癌病寄主植物的地区根癌病均有不同程度的发生。目前生产上明显出现为害的有樱桃、桃树、李子、杏树、葡萄、苹果、梨树、海棠、山楂、核桃、杨树、樱花、玫瑰、月季、啤酒花等果树、林木和花卉，不同地区发生情况不同。根癌病的症状表现是在植物的根部（有时在茎部，所以也称冠瘿病）形成大小不一的肿瘤，初期幼嫩，后期木质化，严重时整个主根变成一个大肿瘤。病树树势弱，生长迟缓，产量减少，寿命缩短，甚至死亡，影响苗圃苗木的质量和成树的生长。重茬苗圃发病率在20%～100%之间不等，发病重的甚至造成毁园。根癌病菌可较长时间的存活在土壤中，从植株的伤口侵入，随苗木的调运进行远距离传播，是土壤传播加苗木传播的细菌性病害。此病菌的致病方式是将其致病质粒上的一段DNA整合到植物的染色体DNA上，随着植物本身的生长代谢来刺激植物细胞增生形成肿瘤，而病原细菌的细胞并不进入植物的细胞。鉴于根癌菌来源于土壤，所以防治的时间应选择在种子或植株接触未消毒的土壤之前进行种子或苗木的处理，从根本上阻止根癌菌的侵入。伤口是根癌菌唯一的侵染途径，所以保护伤口是最好的防治切入点。根癌菌具有非常特殊的致病机制，一旦有根癌症状表现就证明T-DNA已经转移到植物的染色体上，再用杀细菌剂杀细菌细胞已无法抑制植物细胞的增生，更无法使肿瘤症状消失。目前，利用抗根癌菌剂对植物根癌病进行生物防治是非常实用可行的方法。中国农业大学植物病理学系细菌课题组利用引进的国外K84菌株研制成抗根癌菌剂1号，已经成功用于防治我国多种果树根癌病；并且，分离、筛选到一些具有自主知识产权的根癌病生防细菌，可以弥补国外K84菌株的抑菌谱缺陷。本项目以其中一株高效菌株AE进行研究，以形成可以防治多种植物根癌病的抗根癌菌剂2号，解决国外K84菌株只对核果类果树根癌病有效的问题和局限。以活菌量和抑菌活性为指标，通过单因子和正交试验，从18种液体培养基筛选得到1种相对最适的发酵培养基，明确了在小型发酵罐的发酵条件：温度26～29℃，接种量1.5%～2.5%，罐压0.03～0.05MPa，通气量0.6～0.8（V/V·min）。在发酵培养时，0～6h为迟滞期，6～13h为对数期，13～22h为稳定期，22h以后为衰退期。培养21h细胞数量最多，达到1.6×1012cfu/ml；24h时发酵物对根癌菌的抑制作用最强。通过筛选，确定草炭可作为吸附剂，甲基纤维素和黄原胶可作为防护剂和稳定剂，并将发酵终产物制成了10×108 cfu/g的菌剂。该菌剂在室温（20～25℃）保质期约为100天。在不同地区的田间应用示范证明该菌剂对根癌病的防治效果在70%以上，并且防治效果与菌剂的应用方法有密切关系。

在自然界，植物、微生物和环境之间的关系是极其复杂的。只有详细了解生防微生物在植物根际或叶围与病原物及其他生物、植物及其分泌物、土壤及各种环境因子之间的相互作用及其变化规律，才能有效地调控无机、有机环境，更好地发挥生防微生物的防病功能[1]。国内外在探索环境因素在植物与微生物互作过程中的影响方面，已经开展了较多工作，包括温度、湿度、降雨、光照等气候条件，土壤理化性质，作物栽培条件等。在纳米技术出现之前，人们很难认识到自然环境中的纳米颗粒物对微生物的影响。近年来，大气等环境中纳米颗粒（超细颗粒物）的生物效应已开始深入研究[2，3]，如光催化纳米二氧化钛对很多微生物都具有杀菌作用[4，5]。这样对于暴露在自然条件下的细菌尤其是叶围微生物，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的一个重要考验。蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus 905菌株是本实验室从植物上分离获得的生防细菌，具有促进植物生长，增强农产品品质和防治多种植物病害的功效[6]，并已开发应用于农业生产，取得了预期的经济、生态及社会效益。前期研究发现，离体条件下该菌株在纳米颗粒光催化作用的影响下存活率明显降低。二氧化钛表面产生的·OH和其他如H2O2、O·2等活性氧都参与了灭菌作用[7]。鉴于光催化纳米二氧化钛具有广谱的杀菌作用，我们必须考虑到它对于自然界中有益微生物的影响。本研究以已在生产中应用的有益芽孢杆菌（Bacillus cereus 905）为研究对象，分析纳米TiO2作用下，该细菌在黄瓜叶围存活能力的变化，有助于阐明纳米颗粒对植物叶围微生物的影响。分别称取适量的纳米TiO2（P25，Degussa Co.），高压灭菌，保存于暗处。使用前加入无菌磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0），超声波水浴振荡30min使纳米TiO2均一地分散于溶液中。Bacillus cereus 905（GFP），由中国农业大学植病系生防室分离保存并用GFP标记[8]。将B.cereus 905（GFP）接种至含有相应抗生素的LB培养基，30℃160 r/min悬浮振荡培养过夜，1000×g离心收集菌体，用无菌磷酸缓冲液洗涤菌体两次，收获的菌体重新悬浮于磷酸缓冲液中，菌体浓度由平板活菌计数法来确定。所有试验选择在日光温室生长的，4片真叶龄的健康黄瓜植株（Cucumis sativus cv.CAU NO.32）上进行。用B.cereus 905（GFP）菌悬液（108CFU/mL）喷雾接种叶面，或直接将叶面浸润菌悬液3s钟接种。这样的接种程序可以达到107CFU/叶的接种量。接种1h后用美术喷笔（Airbrush，HD-470，台湾）将TiO2悬浮液（0.2mg/mL）均匀喷雾在接种过的叶面上。使用美术喷笔是为了使TiO2以极小的雾粒（平均体积750μm3）覆盖叶围，既不蘸湿叶面也避免了叶围微生物的空间移动[9]。处理后的植株继续在日光温室内培养一定时间后，取样进行原位观察或平板回收。每个处理，随机取5片叶子，每片叶子随机切割6个1cm×1 cm的组织用以原位观察，用激光共聚焦扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，Nikon EZ-C1）迅速扫描叶的上表面，寻找发绿色荧光细菌，操作要求熟练，防止荧光淬灭。每个取样点，每个处理随机取5片叶子，每片叶子置于预装30mL无菌缓冲液（0.1mol/L磷酸缓冲液，0.1%Bacto-Peptone，pH 7.0）的离心管或灭菌袋中，超声波水浴振荡7min，充分洗脱叶围微生物[10]。叶围洗脱液梯度稀释后，涂布至含有相应抗生素的LB平板上，30℃培养1～2天，通过菌落计数估计B.cereus 905的群体数量。对于纳米二氧化钛光催化杀菌作用机制的研究表明，二氧化钛吸收波长≤387.5nm近紫外光的光能，产生·OH，以及H2O2、O2等活性氧，从而起到杀灭B.cereus 905的作用，纳米二氧化钛本身对于B.cereus 905没有暗毒性[7]，则实验中同时设一个低水平的光照条件作为参比。由于是利用太阳光作为光源，能穿透玻璃到达植物叶面并被纳米二氧化钛所吸收利用的光波绝大多数为UVA（320～400nm），在日光温室的一角通过设遮阳网来创造低UVA剂量的光照条件。纳米二氧化钛处理后的植株继续在日光温室内培养8h，立即取样进行原位观察或平板回收。8h内低UVA剂量的光照条件和正常日照条件下的平均UVA辐射强度分别为0.2mw/cm2和1.3mw/cm2。图1 纳米二氧化钛对B.cereus 905（GFP）在黄瓜叶围存活能力的影响Figure 1 The impact of nano-TiO2 to the survival of B. cereus 905 on the cucumber phyllosphere如图1所示，两种不同UVA剂量光照8h后，在纳米二氧化钛的影响下，B.cereus 905的残余量分别降低为对照（纳米二氧化钛浓度为零）的52.4%（0.2mw/cm2）和11.6%（1.3mw/cm2）。对照处理B.cereus 905的存活能力保持在106CFU/叶的水平，甚至在低UVA剂量的光照条件下，纳米二氧化钛处理的B.cereus 905的存活能力也能维持与对照同一数量级的水平；而在高UVA剂量的光照条件下，B.cereus 905的存活能力明显下降，甚至发生数量级的变化，群体数量比对照下降了88.4%。原位观察结果也与平板回收的结果保持一致（见图2）。对每个叶片随机切取组织块扫描观察发现，在所有的处理中不论是单个细菌还是细菌聚集体，它们在叶围的存在位置与叶表面的结构特征有关。叶表面对于细菌来说是一个非常不平坦的生活环境。它实际上是掩藏有许多不同结构的区域的集合体，包括腺毛、钩毛、气孔、表皮细胞和纹理等。大多数观察到的细菌位于叶的纹理或腺毛处，也有一部分位于表皮细胞上或气孔附近。在纳米二氧化钛处理的叶面，观察到的细菌数量较少，并且很难观察到单个细菌，大多数细菌以聚集体的形式存在。Monier J-M和 Lindow SE也发现菜豆叶面菌Pseudomonas syringae以单个细胞的存在形式比以聚集体的形式对于环境的干燥胁迫更为敏感[11]。图2 Bacillus cereus 905（GFP）在黄瓜叶围存活情况（原位观察）Figure 2 The survival of Bacillus cereus 905 on the cucumber phyllosphere（Microscopy of Bacteria in Situ）本研究表明，在正常日照情况下，B.cereus 905的存活能力明显下降，群体数量比对照下降了88.4%。无论是原位观察还是传统的平板回收结果说明，受二氧化钛光催化杀菌作用的影响，有益微生物B.cereus 905在黄瓜叶围的存活能力明显降低，这与在离体条件下得到的结论[7]相一致。鉴于光催化纳米二氧化钛广谱的杀菌作用，我们必须考虑到它对于自然界中有益微生物的影响。对纳米颗粒物生物效应的研究，是一个急需研究的领域。空气及植物表面等许多地方都存在许多纳米级颗粒，对于暴露在自然条件下的细菌，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的一个重要考验。尤其是随着纳米包膜肥料、纳米土壤改良剂、二氧化钛光合作用促进剂等的产业化，以及农业生产中的投入使用，会使越来越多的人们注意到这一问题。目前对于纳米颗粒作为环境因素对植物、微生物影响的研究并不多见，本文探讨了有益微生物在植物表面受纳米颗粒影响而产生的存活能力问题，但如何创造生防微生物的适宜环境，或改进其对环境的适应能力以提高生防制剂效果的稳定性，还需要进一步深入的研究。

木霉菌（Trichoderma spp.）广泛存在于土壤及其他基物中，作为生防菌以其生长速度快，产孢量大、作用谱广、作用机制多样、能在植株、土壤中增殖并形成有效群体等诸多优势而备受关注。我们针对蔬菜上常见病害，从土壤中分离、筛选获得对蔬菜病原菌具有较强抑菌活性的绿色木霉菌株Tr9701，通过对其产几丁质酶活性等对其抗病机理进行了初探，同时试验了其在黄瓜叶片、根部的定殖能力，为今后开发可替代某些化学农药的微生物杀菌剂做了基础性工作，现将初步研究结果记述如下。1.1.1 供试菌株 绿色木霉Tr9701（Trichderma viride），由天津市植物保护研究所生防室筛选、鉴定。供试病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），由天津市植物保护研究所病害室分离、鉴定。1.2.1 绿色木霉菌制剂几丁质酶检测据Harman等的方法[1]，在胶体几丁质培养基中培养绿色木霉菌，进行产几丁质酶预试验，然后将绿色木霉菌分生孢子液接种到合成诱导液体培养基中诱发几丁质酶产生，以不加胶体几丁质为阳性对照，在28℃，150r/min振荡培养，连续提取培养液制备几丁质酶粗提液。检测采用还原糖法[2]处理，在试管中加入几丁质酶粗提液、10g/L胶态几丁质各1ml，37℃恒温水浴30min，加入DNS10ml，混匀后沸水浴10min，用水冷却至室温，观察颜色变化，以100℃高温灭活处理15min几丁质酶粗提液为对照，试验重复3次。1.2.2 绿色木霉几丁质酶粗提液对病菌的抑菌活性测定 将黄瓜立枯丝核菌、番茄灰葡萄孢霉菌菌丝块转移到平板上，每平皿接种4块，分布于4角，平皿中心放滤纸片并加入100μl几丁质酶粗提液或阳性对照液，重复3次，空白加入等量无菌水，定期观察抑菌圈大小。1.2.3 绿色木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用的显微观察 将灭菌赛璐玢膜置于直径90mm的水琼脂培养皿上，在平板两侧各植入经活化培养的绿色木霉和立枯丝核菌菌丝块，25℃下对峙培养，待菌丝接触后置于光学显微镜下观察。1.2.4 绿色木霉菌在黄瓜叶片和根部的定殖 取菜田表层10cm深处土壤，混腐熟的猪粪和蛭石（按3：1：1比例），过筛后，用150倍甲醛液消毒，边喷边混，喷匀后堆起，盖塑料布闷5天，然后晾晒14天，待残药挥发后铺于苗床待用。同时将冰箱保存的绿色木霉菌活化，转接到小麦粉培养基上，在25℃温度下培养7天，培养基上长满菌丝和孢子后，在组织捣碎机中捣碎、过滤，配成绿色木霉菌孢子悬浮液（5×106个孢子/ml）备用。木霉菌叶面定殖：将培养制成的孢子悬浮液用消过毒的手持喷雾器喷雾，均匀喷至黄瓜叶面正反两面，直到叶面上均匀布满一层细微水珠而不流淌为止。喷雾后1h取第一次样，以后每隔一周取一次样，共4次。每次每处理取的叶片剪成0.5cm见方小片，称量取样叶片加入10倍无菌水中振荡（120r/分）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。木霉菌根际定殖：将培养制成的孢子悬浮液，均匀浇灌至黄瓜根部，直至黄瓜苗根部土壤全部浸润为止。浇灌后1h取第一次样（地下1～2cm处根围土壤），以后每隔3天取一次样，共4次。检查时，分别称取根围土壤1g，加入无菌水20ml中振荡（120rpm）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。通过预试验，绿色木霉菌Tr9701在胶体几丁质培养基上生长可以形成显著几丁质酶解透明圈，因此进行了绿色木霉菌几丁质酶的诱导试验。诱导条件下几丁质酶粗酶液加入DNS后变为深棕红色，与阳性对照相比有显著差异，说明绿色木霉菌菌株产生几丁质酶，且经诱导处理的绿色木霉菌几丁质酶产生量明显提高，经检测，在培养第5d时达到最大值。绿色木霉菌Tr9701几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌活性在平皿接种后2天内，立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌丝生长迅速，但菌丝接近木霉几丁质酶粗提液接种点周围时，生长缓慢，最后停止，从而形成明显抑菌圈。空白对照无抑菌圈，立枯丝核菌菌丝长满平皿，灰葡萄孢霉菌丝长满平皿并形成大量菌核。试验表明，绿色木霉Tr9701的几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌圈直径分别为28mm和15mm，比阳性对照的抑菌圈直径大，其差异达到了显著水平。显微观察显示绿色木霉菌对立枯丝核菌具有较强的寄生能力，绿色木霉菌丝与立枯丝核菌菌丝接触后并列生长或缠绕，有时以钩状结构入侵立枯丝核菌菌丝。在接触后期则观察到被寄生的立枯丝核菌菌丝断裂和消解的现象。2.4.1 绿色木霉菌在黄瓜叶面的定殖 绿色木霉菌在叶面上的定殖动态见表1。由结果可知，绿色木霉菌在叶面环境中由于各种条件的影响，第一周内的菌量比初始菌量降低。此后绿色木霉菌适应了叶面环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为1.02×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.12×104cfu/g叶片。镜检观察绿色木霉菌Tr9701在叶面喷雾后，主要定殖于叶面气孔周围、腺毛基部及叶面凹陷处。这些位点或是分泌物产生处，或是叶面水分分布较多处，能为绿色木霉菌的生长繁殖提供适宜的条件。同时，这些位点也是其他病原菌的竞争位点，通过绿色木霉菌的人工接种，相比病原菌具有种群数量大，出现早的特点。因此，绿色木霉菌对这些位点的抢先占领，不仅有利于本身的生存，而且使黄瓜叶面受到保护，免于病原菌的侵染。重复调查时间1h3天7天14天21天28天11.241.210.941.150.830.1820.960.950.810.920.660.0831.151.080.860.980.790.1441.371.400.951.030.720.10平均1.181.160.891.020.750.12表1 绿色木霉菌孢子在黄瓜叶片上定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）2.4.2 绿色木霉菌在黄瓜根际的定殖 绿色木霉菌在黄瓜根际土壤中定殖结果见表2。由结果可知，第一周内土壤的菌量比初始菌量降低，可能是在根际土壤环境中，由于各种因素的影响，木霉菌受到一定抑制，此后绿色木霉菌适应了土壤环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为2.64×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.68×104cfu/g叶片。在调查中发现，绿色木霉菌定殖黄瓜根部能力受水分含量和pH值影响明显，水分偏高或偏低都影响绿色木霉菌菌株在黄瓜根部的定殖，pH偏酸性条件下的定殖量明显高于偏碱性条件下的定殖。重复调查时间1h3天7天14天21天28天12.432.371.852.521.090.6422.692.592.032.731.240.7232.362.321.892.611.080.6542.842.561.942.701.110.71平均2.582.461.922.641.130.68表2 绿色木霉菌孢子在黄瓜根部定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）木霉菌腐生性强，适应性广，生长和繁殖快，可迅速利用营养和占据空间，是当前微生物菌剂控制病害的研究热点[3]。本试验结果表明，我们所筛选的绿色木霉菌Tr9701有较强的产几丁质酶活性，且经诱导处理酶产量明显提高，其酶粗提液经试验对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉有显著抑制作用，通过诱导产生的木霉几丁质酶在对于抑制病原菌的生长具有重要意义。经显微观察发现，绿色木霉Tr9701对于立枯丝核菌是通过趋向生长、识别、接触缠绕和穿透，寄生于病原真菌之上，对立枯丝核菌具有较强的寄生能力。此现象证明，当绿色木霉菌遇到立枯丝核菌等病原菌时，受到刺激和诱导，产生溶菌酶，抑制立枯丝核菌等的生长，并可降解菌丝。生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本研究表明，绿色木霉菌可以在黄瓜叶面和根部定殖。据Darah（1991）报道，根圈微生物的分布与沿根的可溶性碳的分布距离有关，微生物量的积累有赖于根分泌物的释放，因此添加一定的营养可以促进绿色木霉Tr9701的定殖。本研究进一步证明，绿色木霉Tr9701产几丁质酶、寄生、定殖能力强，是较好的生防材料。当前由于生防微生物控制植物病害具无污染、价格低廉的优点，具有广阔的应用前景。因此对绿色木霉菌Tr9701的发酵工艺、田间应用范围等有待进一步研究。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起的一种在我国乃至全球分布的重要病害。尤其是保护地番茄，其高湿条件为该病流行创造了有利的发病条件。目前番茄生产由于缺少抗病品种，防治番茄灰霉病仍主要依靠化学防治，多采用速克灵等化学药剂喷雾，但在连续使用的情况下，病菌逐渐产生了抗药性，防效逐年下降。此外，大量使用化学药剂也造成了严重的农药残留问题和环境污染问题。近年来人们通过大量筛选和利用抗灰霉病的有益微生物及其代谢产物，使生物防治日益成为番茄灰霉病控制中的一条重要而有效的途径。作者研究了本实验室筛选的拮抗放线菌B1菌株对番茄灰霉病的生防效应，并对其分类地位进行了初步鉴定，为该菌株的应用与开发提供基础。B1菌株是从北京番茄温室土壤中筛选得到的一株拮抗菌，平板抑菌试验结果表明，它对多种植物病原细菌和真菌有较强的抑制作用，其中对灰葡萄孢的抑制能力最强，抑制率达86.3%。B1代谢产物对番茄灰霉菌的菌丝有扭曲、膨大等致畸效应。室内离体检测表明B1菌株对番茄离体叶片和果实的灰霉病均有较好的防治效果。温室试验证实B1菌株对番茄苗期的灰霉病的防治效果在60%以上。根据B1菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，将其鉴定为链霉菌属淡紫灰类群（Streptomyces lavendulae）。

洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。1949年美国植物病理学家Burkholder首次发现B.cepacia可以引起洋葱酸皮病[1]。随后在20世纪50年代人们从第一例由B.cepacia引起的心内膜炎开始，发现该菌广泛存在于医院，并且可以使人类患上多种疾病，尤其是囊性肺纤维化（Cystic fibrosis，简称CF）病人的易感细菌之一，严重的会因此患“洋葱伯克霍尔德菌综合症”致死。最近研究表明，该菌致人死亡的一个原因要归咎于它含有脂多糖（Lipopolysaccharide）分子[2]。在进行医学研究的同时，发现该菌在工业和农业上有生物降解、生物防治等功效，对农业生产和环境保护起着重要的作用，具有广泛的应用前景。近年来，随着细菌分类技术的发展，洋葱伯克霍尔德菌已不仅只是作为一个种，而是一组基因型不同、表型相近的复合物，称为洋葱伯克霍尔德菌复合型（Burkholderia cepacia complex，简称Bcc）[3]。本文将在农业、分类地位等方面对Bcc的研究进展做一综述，以达到全面了解该菌的目的。人类第一次发现伯克霍尔德菌是由于它导致了洋葱酸皮病，该病菌主要分布在土壤和灌溉水中，在洋葱鳞茎形成后，从其因收割等原因造成的伤口侵入，或者是黏在叶部的菌被水冲刷进入组织内引起鳞茎腐烂。Ulrich在1975年研究表明[1]，该病原菌在低pH值环境下可以产生一种内多聚半乳糖醛酸酶，使洋葱组织软化，利于病原菌的入侵和扩展。后来郭道森等人研究表明，该菌与松材线虫共同侵染黑松和马尾松，导致松林大面积死亡[4]，在后续的研究中发现，松材线虫的分泌物及死虫体均可促进该菌株的生长繁殖和致病作用，且活线虫的促进作用比死虫体更加显著，这可能是由于松材线虫提供给该菌株某些重要的营养物质[5]。2005年，意大利西西里东部地区种植的天堂鸟（Strelitzia reginae Aiton）幼苗（苗龄2～3个月）发生新病害，鉴定发现致病菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli），这是关于该菌导致天堂鸟叶斑病及枯萎病的首次报道。在植物体上广泛存在着一些细菌，它们都具有诱发植物体内水分结冰的作用，称为冰核细菌。在没有冰核细菌存在的植物能耐-7～-8℃的低温而不发生霜冻，但是在一些B.cepacia 细菌存在的情况下，同样条件的植物在-2～-3℃可诱发多种植物细胞水结冰而发生霜冻。张耀东等从菠菜上分离到一株具有冰核活性的Bcc菌株[6]。1.3.1 对有毒物质的降解 一些工业排放物中含有大量的有害芳香烃类物质，随着工业化进程的加快，残留于自然环境中的芳香烃类物质含量急剧增加，如何解决这类物质造成的危害，成为研究者要解决的问题，而利用微生物降解是消除其危害的重要途径之一。洋葱伯克霍尔德菌可以利用多种物质为唯一碳源，这意味着其能够以土壤和地下水污染的有毒且难降解的物质（邻苯二甲酸盐、除草剂和氯代烃类化合物等）为碳源并将其降解[7]。例如，Bcc的一个菌株G4可通过由苯酚诱导的芳香族途径将三氯乙烯降解，由于苯酚是环境优先污染物之一，因而不宜被推广使用；但该菌株的突变体G45223 PR1可以不利用任何诱导物而直接降解三氯乙烯[8]。另外，许多芳香烃化合物在降解过程中都会形成中间产物邻苯二酚，细菌可以通过邻位裂解和间位裂解两种途径继续降解邻苯二酚[9]。刘涛等[10]从炼油厂废水中分离筛选到一株苯酚高效降解的洋葱伯克霍尔德菌L68，该菌株可产生邻苯二酚2，3-双加氧酶[11]，而邻苯二酚2，3-双加氧酶是降解芳香族化合物的关键酶，在间位降解途径中，该酶可以催化邻苯二酚的苯环裂解，转化为2-羟黏糠酸半醛。因此，洋葱伯克霍尔德菌对消除芳香烃类化合物的污染具有重要作用。另外，洋葱伯克霍尔德菌对化学农药也有很强的降解作用。如，Sarfraz Hussain 等人研究发现，在pH值为8.0，温度为30℃时，该菌对α-硫丹和β-硫丹的降解率达90%以上，从而减少了杀虫剂硫丹（Endosulfan）对土壤和地下水的污染[12]。1.3.2 对油脂的降解 洋葱伯克霍尔德菌降解油脂的特性在国外已有研究，Pooja Rathi，Hustavova等人报道了该菌产脂肪酶应用于催化酯化水解反应等研究[13]，洋葱伯克霍尔德菌能在降解利用油脂的同时还分泌出一定量的胞外脂肪酶，同时通过所产生的脂肪酶等降解酶系作用于油脂，将其分解氧化为低级脂肪酸、甘油、醇类等低分子有机物，最后降解为H2O、CO2等代谢产物[14]。徐保成[15]等人对该菌所需的降解工艺条件进行优化研究，结果表明在优化的油脂降解条件下（pH值7.0，30℃，溶解氧3.0mg/L），处理初始油脂浓度1000mg/L废水，24h后其油脂降解率达到90%以上，COD（Chemical Oxygen Demand）去除达到92%。B.cepacia产生的脂酶可以催化拆分外消旋化学农药，使其变为光学活性农药，从而成倍地提高了药效，而且减轻了生物体内的积累与毒副作用，避免了不必要的环境污染[16]。洋葱伯克霍尔德菌可以防治多种植物病害，如从樱桃果实表面和伤口上分离获得的洋葱伯克霍尔德菌对甜樱桃褐腐病表现出显著的抑制效果[17]；郑维等从堆肥样本中分离的洋葱伯克霍尔德菌株CF-66具有广谱抗菌活性，并初步鉴定该菌属于洋葱伯克霍尔德菌基因型Ⅴ[18]；李纪顺等对伯克霍尔德菌B418进行了研究，表明该菌对小麦纹枯病、小麦全蚀病和番茄南方根结线虫病有很好的防治效果[19]。陈京元等从湿地松苗根际分离得到1株B.cepacia C23菌株，对引起湿地松猝倒病的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、链格孢菌（Alternaria alternata）有明显的抑制效果。洋葱伯克霍尔德菌的防病机制主要为其能产生多种具有抗菌活性的代谢产物，如铁载体（Pyochenlin、Pyoverdine）、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、Cepaciamide A（B）、Cepacidine A（B）、Cepacin A（B）；菌株H111 能够有效杀死线虫Caenorhabditis elegans，其作用机理主要是由该细菌产生的细胞外毒素所致死[20]。B.cepacia AMMDR1可以抑制由瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）和根腐丝囊菌（Aphanomyces euteiches）引起的豌豆和甜玉米苗猝倒病，作用机理主要是该菌抑制游动芽孢的裂解，阻止孢囊的萌发而影响病原菌的生长[21]。在不断的研究中发现，该菌可以与杀菌剂共同使用，如I.Omar等人发现，在对大豆根腐霉病菌（Fusarium oxysporum）引起的番茄冠根腐病的研究中，B.cepacia菌株C91与低浓度杀菌剂混合使用，相比单独使用高浓度杀菌剂，杀菌效果提高了20%[22]。这不但减少了杀菌剂的使用，同时减少了杀菌剂对环境的污染。美国环保署（EPA）已经批准了两种以洋葱伯克霍尔德菌为主要成分的生防菌剂的生产，其商品名为Deny和Intercept，Deny用于防止Rhizoctonia spp.、Pythium spp.、Fusarium spp.和线虫引起的病害，而Intercept则用于防治Rhizoctonia solani、Fusarium spp.、Pythium spp.引起的病害[23]。具有拮抗作用的细菌往往与植物的生长有很大的关系，这些细菌都可产生一些抑制真菌生长的物质，如：铁载体（Siderophores），细胞溶酶的分泌物，抗生素等。对真菌生长的抑制就可以直接促使植物生长[24]。B.cepacia可以产生铁载体，一方面根际促生菌铁载体的产生很快耗尽了病原菌生存所需要的铁，从而使病原菌的繁衍和侵染能力大大下降；另一方面根际促生菌通过铁载体向植物提供铁营养，从而使植物获益[25]；另外，B.cepacia还可以产生抗生素有效地抑制周围其他微生物的繁衍。同时，B.cepacia的一些菌株具有固氮和产生吲哚乙酸（IAA）的作用，有助于植物对营养物质的吸收[26]。Bcc菌株具有较强的溶解磷酸盐的能力，推动植物对释放的磷的吸收，促进植物生长，Babu-Khan等克隆到其溶解磷酸盐的基因[27]。另一方面其通过对病原微生物的生物防治，减轻或抑制有害的根围微生物，从而间接的促进植物生长。例如，玉米种子被Bcc菌株MCI7包衣后，其植株感染病原镰刀菌的几率大大降低，且植株鲜重和株高均显著增加[28]。B.cepacia 原名Pseudomonas cepacia，1950 年首次被Burkholder报道可引起洋葱酸皮病[29]。该菌的其他名字还包括eugonic oxidizers group 1，Pseudomonas kingii和Pseudomonasmultivorans[30]，但是相关研究明确指出这些命名是P.cepacia的同义词，而且P.cepacia具有命名的优先权[31]。因此，这些命名没有被写入细菌手册，直到1981年，Palleroni 和Holmes才重新找到依据区分这些命名的不同[32]。1992年Yabuuchi 等正式将该菌及其他6个属于rRNAⅡ群的假单胞菌（P.solanacearum，P.pickettii，P.gladioli，P.mallei，P.pseudomallei 和P.caryophylli）归为一个新属，即伯克霍尔德菌属（Burkholderia）。与Pseudomonas属不同的是，该属被归为变形菌门（Proteobacteria）[33]。当Burkholderia属的分类地位被确定以后，该属已包括超过30个不同的种：B.cepacia（典型种），B.caryophylli，B.mallei，B.pseudomallei，B.gladioli，B.plantarii，B.glumae，B.vietnamiensis，B.andropogonis，B.multivorans，B.glathei，B.pyrrocinia，B.thailandensis，B.graminis，B.phenazinium，B.caribensis，B.kururiensis，B.ubonensis，B.caledonica，B.fungorum，B.stabilis，B.ambifaria，B.hospital，B.terricola，B.sacchari，B.tropicalis，B.brasilensis，B.anthina，B.dolosa，B.cenocepacia，B.xenovorans，B.tuberum，B.phymatum。通过研究得知B.caryophylli，B plantarii，B.glumae，B.andropogonis是植物的致病病原菌，能够使不同种属的植物患上根腐、叶斑、条斑等病害。在不同植物中分离得到的B.vietnamiensis，B.kururiensis，B.tropicalis，B.brasilensis，B.tuberum，B.phymatum，B.caribensis有促进根瘤形成，增强固氮的能力，同时促进植物根的生长。B.mallei和 B.pseudomallei则能够引起人和动物的鼻疽病。对于B.glathei，B.graminis，B.phenazinium，B.caribensis，B.caledonica，B.hospital，B.terricola，B.sacchari在环境、生态中所起的作用还不是很清楚。同时，还有一些具有多重作用，可以是植物致病菌，植物有益菌或是人类的机会致病菌，例如：Burkholderia cepacia complex，Burkholderia gladioli 和 Burkholderia fungorum[34]。从20世纪90年代中期开始，一些研究者发现来源于各种环境的Bcc分离物具有明显的遗传异质性，1996年，有报道说利用分子鉴定和临床观察，发现伯克霍尔德菌至少有3个不同的基因型是CF病症的致病菌[35]。直到1997年，Vandamme等运用多相分类研究方法对从CF病人中分离到的致病菌进行研究，才发现所设定的B.cepacia种中，至少存在5种不同的基因型[36]。包括B.vietnamiensis（基因型V）、B.multivorans（基因型II）、基因型I，III和 IV。这5种基因型被统称为伯克霍尔德菌复合型（B.cepacia complex）。利用不同的方法从医学和环境微生物的角度对伯克霍尔德菌复合型进行了探索研究，其中包括使用不同的选择性培养基。结果发现，农业研究中利用的培养基，能从土壤和植物根际附近发现大量的伯克霍尔德菌复合型的族群[37]；在医学研究中，几乎无法从自然界中发现伯克霍尔德菌复合型的存在[38]。直到伯克霍尔德菌分类的又一次改变，才使这些固有的不同有机的联系起来，一些研究者发现基因型IV与Bcc中的其他基因型有明显的差异，于是被归类B.stabilis[39]。接着从美国和英国的CF致病菌中分离出基因型VI，它除了与B.multivorans没有差异外，与其他基因型均有差异[40]。从人类致病菌与环境中都能分离B.ambifaria（基因型VII），因此它也具有生防菌的特征。最近，发现B.pyrrocinia（基因型Ⅸ）也属于B.cepacia complex[41]。因此，已报道的洋葱伯克霍尔德菌复合型由9个不同基因型组成，分别是B.cepacia（基因型Ⅰ）、B.multivorans（基因型Ⅱ）、B.cenocepacia（基因型Ⅲ）、B.stabilis（基因型Ⅳ）、B.vietnamiensis（基因型Ⅴ）、B.dolosa（基因型Ⅵ）、B.ambifaria（基因型Ⅶ）、B.anthina（基因型Ⅷ）、B.pyrrocinia（基因型Ⅸ）。后来，Yabuuchi E等人在泰国某地的表层土中分离得到的B.thailandensis的一株，被重新归类为Burkholderia ubonensis，经过鉴定初步断定也归类为B.cepacia complex[42]。各基因型间DNA-DNA同源性为30%～50%，其16S rRNA 和recA 基因序列相似性很高，分别为98%～99%和94%～95%[43]。直到目前，对Bcc的基因型组成仍在研究中，Zhang L等人在玉蜀黍和水稻的根际发现了大量的Bcc菌株，并且通过Bcc recA基因的同源性的分析，发现分离所得的Bcc R456菌株可能属于一种新的基因型[44]。虽然能从不同的环境条件下分离获得大量的Bcc，但却不清楚Bcc株系主要的存活环境。事实上，只有很少的研究涉及环境中Bcc的生态特征，一些研究者也仅仅是对Bcc的一个或几个基因型进行研究[45]。现有的伯克霍尔德菌复合型中有许多有生防效果或是作为植物促生剂，现今生产B.cepacia生物农药的菌株都来源于环境，但问题是，对这些菌株是否是非致病菌也无法区分，因为除了Bcc基因型Ⅵ只能从CF病人中分离到，基因型Ⅸ只从土壤中分离到以外，其他所有基因型的B.cepacia均可从环境和医院中分离[46]。同样，无法很清楚的在菌株基因型或是表现型方面来区分环境菌和人类致病菌。同时，每年都可以从CF的致病菌中获得新的Bcc株系，并且也能够从自然环境中获得这些菌株[47]。因此，如何区分环境菌和人体致病菌以及其是否具有致病性，对应用于农业上的Bcc菌株进行风险评估是必要的，也将是今后的研究难点和热点之一。目前，对细菌的鉴定一般都先选择合适的选择性培养基培养分离出的样本，然后利用生理生化手段检测分离到的菌株，接着利用SDS-PAGE技术，全细胞蛋白电泳，16S rDNA序列分析手段鉴定出分离所得样本的属，最后配合RFLP探针技术或AFLP探针技术以确定菌株的基因型。现有的伯克霍尔德菌复合型由9个不同的基因型构成，各个基因型在形态上非常相近，这就需要非常便利的生物化学的鉴定手段和具有针对性的分子鉴定方法对各个基因型进行精确的区分[48]。利用16S rDNA测序、recA-RFLP分析、recA 基因特异引物PCR检测、DNA-DNA 同源性分析以及全细胞蛋白电泳（PAGE）方法可区分Bcc中的一些种，但还没有一种技术可以针对性的区分出每个基因型。因此，寻找一种简单可行可靠的鉴定技术是今后研究的热点之一[49]。Bcc致病毒力因子包括脂肪酶、蛋白酶、溶血素、脂多糖、过氧化氢酶、内毒素等，以紫花苜蓿作为植物模型研究Bcc的毒力，发现9个基因型中除了B.multivorans 和B.stabilis外，其余都可以从发病的紫花苜蓿上分离获得[50]。但植物与人类病原菌存在着差异，如革兰氏阴性人体条件致病菌绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和植物病原菌丁香假单胞菌（P.syringae）均存在Ⅲ型蛋白分泌系统，但后者对人和动物不致病，表明致病因子存在并不能充分说明其能致病。为了确定细菌致病性毒力的决定因子，Chung J W等人利用蛋白质组学描述来比较两种B.cenocepacia在老鼠肺上的存在状态，发现临床分离所得的C1394 很快被致死，C1394mp2依然存活。利用Two-dimensional（2D）凝胶电泳发现从易感病寄主上得到的C1394mp2，缺少烷基氢过氧化物还原酶亚基C（AhpC）蛋白位点，反之增加了鞭毛蛋白，这使C1394mp2增强了在高温和低pH值条件下的氧化应激能力。这揭示了B.cenocepacia致病毒力在易感模型上出现不同的表现与应激能力的内在原因[51]。对于使用易感动物作为模型进行研究是一个进步，但是对于动物模型的选择、如何利用等都受到时间、道德等原因的制约，寻找合适的动物模型仍是今后需要解决的问题之一。洋葱伯克霍尔德菌对于人本身来讲，是一种可怕的致病菌，不但污染医院的药品和器具，而且引起可怕的“洋葱伯克霍尔德菌综合征”。对于整个人类来讲，有好也有坏。它是自然界中一些植物的病原菌又是一种重要的生防、环保以及工业用菌，减少了对环境的危害，不少国家把它作为生物农药和环保制剂使用。如何区分哪些是人体致病菌、哪些是植物致病菌、哪些是生防或环保菌，成了一个令人困扰的问题。这有赖于对其生态多样性、致病机制以及分类学的全面了解。只有确定Bcc生防或降解菌株对人体不致病，或者该菌株为单独一个种而不是人体致病菌一员时，才能将其安全的应用于农业生产上，使其为人类造福。现在已经有许多研究者从不同的方面入手来进行研究，但仍有未涉及或很少涉及的领域，如该菌在自然界的分布及多样性研究，其基因型的详细鉴定及针对性的鉴定方法，这些都是需要注意的问题。因此，在今后的研究中，要广泛地参考结合各学科领域的研究进展，充分地认识了解该菌的生物学特性及在不同方面的风险性测试评价，以期更好地使其为人类服务。

豆瓣菜（Nasturtium officinale R.Br.）又名西洋菜、水蔊菜、水田芥，属十字花科豆瓣菜属植物。枝叶柔嫩青翠，性喜冷凉，较耐霜冻，是深受人们喜爱的冬春上市的水生绿叶蔬菜。有关豆瓣菜菌核病国内尚未有专门报道。该病1999年在武汉旱地栽种的豆瓣菜田中仅见零星发生，到2001年春发病田中的发病面积可达1.61%，甚至到10%左右，表明病害有增重的趋势。豆瓣菜的茎、叶、叶柄均可受害。以中、下部贴近地面匍匐或半匍匐生长的枝叶受害最重。田间病害呈点片状发生，不规则分布。因豆瓣菜分枝多，生长繁茂，茎呈匍匐或半匍匐丛生，故发病初期常需拨开丛生状植株，才能发现感病枝叶，后期因植株枯死而呈现近圆形至不规则形病区。茎部受害，水渍状，淡褐色，边缘不清晰，从病处向两端扩展，空气湿度大时生茂密的绵毛状白霉，继而在植株表面及病茎的空腔中菌丝集结成近球形、扁球形、鼠粪状或不规则的菌核。菌核初白色，成熟后黑色，内部白色。罹病植株病部软腐，但无恶臭，最后失水干枯而呈枯草黄色。叶柄症状与茎部同。病叶受侵处灰褐色或浅黄褐色，湿度大时亦生较稀疏的绵毛状白霉，最后病叶腐烂或干枯。该病一般在12月上中旬出现病株，1月下旬至2月上中旬是大棚中豆瓣菜菌核病的盛发期，大棚和露地均在3月上旬病情趋于稳定。在近几年的调查观察中，一直未见浅水栽植的豆瓣菜有菌核病发生，而旱地栽植的豆瓣菜，不论大棚或露地种植的条件下均可受害，并且大棚中的病情有较露地重的趋势。病茎失水干枯后，菌核极易脱落，而病茎空腔内的菌核则随病株残体遗留在土中。该病的初侵染，来自遗留在土中的菌核产生的子囊孢子。子囊孢子不能侵染健壮的枝叶，而极易侵染中下部贴近地面匍匐或半匍匐生长的衰老叶片，此后才能侵染健壮的枝叶。再侵染主要通过病患组织接触，由病部长出的绵毛状菌丝体完成。豆瓣菜的匍匐或半匍匐生长及分枝多、生长繁茂、枝叶交错的植物学性状和病原菌侵染循环特点，决定了其有利于菌核病菌的接触蔓延，而不利于子囊孢子的气流较远距离的传播，因而造成了植株中、下部枝叶发病的现象，这样就使豆瓣菜菌核病具有一定的“隐蔽性”，也导致田间病害呈点片状发生及不规则分布的特点。菌丝管状、无色，有分枝具隔膜，田间自然情况下菌丝体白色绵毛状，在病茎表面及被害茎的空腔里均可形成菌核。在测量的87个菌核中，其大小（长径）为2.0～7.0mm。菌核无休眠期。将菌核置培养皿中双层浸湿的滤纸上，13.5～16.0℃，室内散射光下培养很易萌发。一个菌核可生出一至数个子囊盘，子囊盘高足杯状，初淡褐色，后为暗褐色。柄长短因环境而异，在黑暗无光条件下，柄长可达6.0 cm以上。子囊盘中生有大量子囊和侧丝，子囊无色棒状，内生8个排列一行的子囊孢子。子囊孢子椭圆形，无色单胞，大小8.7～13.7μm×4.9～8.1μm。子囊孢子成熟后稍受震动（如打开供菌核萌发的培养皿的盖），即可看到状如烟雾的子囊孢子放射现象。据上鉴定，认为豆瓣菜菌核的分离物为Sclerotonia sclerotiorum（Lib.）de Bary。这是我们首次在豆瓣菜上发现有由核盘菌引起的菌核病。进一步研究发现该菌菌丝生长温度范围很广，其中在4～5℃时，菌落在PDA平皿上扩展速度为8.3mm/天、33℃时为2.0 mm/天、当温度达到35℃时，菌落几乎停止生长。病菌菌丝生长最适温度是21℃，在此温度下，菌落扩展速度达32.2 mm/天。

Previous studies indicate that the plant genus Allium,including bulb onion(A.cepa L.),can be infected by at least seven species of Botrytis at the stages of growth and/or storage(Nielsen et al.,2002).Of these Botrytis species,three,namely B.aclada,B.allii,and B.byssoidea,were reported to be most commonly associated with neck rot of onion(Nielsen et al.,2002).B.aclada was regarded as synonymous with B.allii until 2003,when Yohalem et al.(2003)suggested that both B.aclada and B.allii are valid names.Further analysis showed that B.allii is a hybrid of B.aclada and B.byssoidea(Nielsen and Yohalem,2001)and the hybrid status of B.allii was confirmed in a molecular phylogenetic study conducted by Staats et al.(2005).In China,B.allii was reported to cause brown rot of onion bulbs(Tan et al.,1997),whereas rot of onion bulbs caused by B.aclada has not been documented in this country.In spring of 2006,a kind of rot disease was observed among sold onion bulbs in the supermarket near the campus of Huazhong Agricultural University,Wuhan,China.Surveys of five randomly-selected stacks of onion bulbs in that market indicated that the percentage of diseased bulbs varied from 6 to 50%.Diseased onion bulbs became soft rotten and abundant conidia were produced on the surface of diseased bulb tissues of onion showing a grey powdery appearance.Eight fungal isolates were obtained from 8 diseased bulbs of onion showing the grey mould symptoms.They were individually incubated on potato dextrose agar(PDA)at 20℃ and identified on the basis of cultural and morphological characteristics.Results showed that all of these isolates produced abundant grey-brownish,ovoid-or oblong-shaped conidia,which were budded from terminal ampullae formed on dichotomously-branching conidiophores.The size of conidia for these isolates varied from 7.6 to 10.4 μm in length and from 4.2 to 5.6 μm in width.No sclerotia were produced by these isolates on PDA even after incubation for 30 days.These characteristics of the investigated fungal isolates are similar to those described for B.aclada by Yohalem et al.(2003).One of the eight fungal isolates,OnionBc-15,was used for further identification using molecular methods.Genomic DNA(gDNA)was extracted from mycelia of OnionBc-15 and used as template for amplification of certain DNA regions.The first targeted DNA region is the internal transcribed spacer(ITS)of the ribosomal RNA gene.It was amplified with the universal primer pair ITS1 and ITS4(Nielsen et al.,2002).A 539-bp DNA fragment was generated,cloned and sequenced(GenBank Acc.No.EU093077).The sequence contained two SphI restriction sites and was 99%identical in nucleotides to that of B.aclada strain PRI006(GenBank Acc.No.AJ716295).It is different from B.allii and B.byssoidea,which have only one SphI restriction site for the ITS1/ITS4-amplified DNA sequence(Nielsen et al.,2002).The second targeted DNA region is the L45-550 sequence(Nielsen&Yohalem,2001).It was amplified with the Botrytis-specific primer pair BA2f and BA1r(Nielsen et al.,2002).A 413-bp DNA fragment was generated,cloned and sequenced.Sequencing analysis showed that the 413-bp DNA fragment did not contain any ApoI restriction sites.This is also similar to B.aclada,but different from B.allii and B.byssoidea,which have one ApoI restriction site in the BA2f/BA1r-amplified DNA sequence(Nielsen et al.,2002).Additionally,three house-keeping genes encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(G3PDH),heat-shock protein 60(HSP60)and DNA-dependent RNA polymerase subunit II(RPB2)were amplified from the gDNA of OnionBC-15 with the specific primer pairs reported by Staats et al.(2005).The generated DNA fragments were 886 bp for G3PDH,977 bp for HSP60 and 1093 bp for RPB2,which were cloned and sequenced.They were assigned with GenBank accession numbers as EU100386,EU100387 and EU093078,respectively.Phylogenetic trees were established on the basis of the sequence information of G3PDH,HSP60 or RPB2 cloned from OnionBC-15 in this study and from the 22 species of Botrytis reported by Staats et al.(2005)using the neighbor-joining(NJ)method implemented in the MEGA3.1 package.Each phylogenetic tree was tested with bootstrap(1000 replicates).Results showed that OnionBc-15 was more closely related to B.aclada and B.allii than to other species of Botrytis in each phylogenetic tree.Therefore,it is appropriate to identify the strain OnionBC-15 as B.aclada.This research was funded by the Natural Science Foundation of China(Grant No.30570079).[1]Nielsen K,Yohalem DS.Origin of a polyploid Botrytis pathogen through interspecific hybridization between Botrytis aclada and B.byssoidea.Mycologia,2001,93:264~271.[2]Nielsen K,Yohalem DS,Jensen DF.PCR detection and RFLP differentiation of Botrytis species associated with neck rot of onion.Plant Disease,2002,86:682~686.[3]Staats M,van Baarlen P,van Kan JAL.Molecular phylogeny of the plant pathogenic genus Botrytis and the evolution of host specificity.Molecular Biology and Evolution,2005,22:333~346.[4]Tan WZ,Wang XY,Zhang LX.Two newly recorded fungal diseases of Allium in Yunnan province,China.J.Southwest Agri.Univ.,1997,19:165~167.[5]Yohalem DS,Nielsen K,Nicolaisen M.Taxonomic and nomenclatural clarification of the onion neck rotting Botrytis species.Mycotaxon,2003,85:175~182.

近些年，由于多种原因的影响，小麦黑胚病发生日趋严重，已经成为生产上的重要问题。由于该病危害，导致小麦籽粒质量和等级下降，影响种子出苗和幼苗生长，已成为小麦生产亟待解决的问题之一[1～5]。一些研究报道，黑胚病的主要病原菌链格孢（Alternaria alternata）可以产生致病毒素，甚至能够引起食道癌变，对人类健康有很大的威胁[6]。虽然一些学者对小麦黑胚病的发病规律、品种抗性、防治技术以及黑胚籽粒对小麦出苗和生长的影响做了不少研究工作，但关于黑胚病菌链格孢的致病机制尚不清楚，对该病原菌的致病毒素未见报道[7～9]。对于毒素的致病机理，一些研究认为，是毒素造成了寄主植物某些生理生化方面的异常从而引起了病害症状[10～17]。本研究的目的是弄清小麦黑胚病优势病原菌链格孢所产毒素的生物活性和基本性质，了解病菌的致病机理，为进一步研究工作奠定基础。1.1.1 供试小麦品种 抗病品种：豫麦47、豫优1号、科优1号；感病品种：豫麦18、豫农9901、漯麦4号；种子由国家小麦工程技术中心和河南省农业科学院小麦所提供。1.1.2 供试菌株 小麦黑胚病菌链格孢（Alternaria alternata），由本实验室分离鉴定和保存。1.2.1 粗毒素的制备 转接黑胚病菌菌种于PDA 培养基上培养7d，然后取直径为6.5mm 大小的菌丝块，接种到150ml pH4的PSK液体培养基中（250ml三角瓶），每瓶一块，在25℃、110r/min恒温摇床上培养10～15天，至菌丝变黑。将培养液用滤纸过滤，滤液经高速离心，取上清液用0.45μm 微孔薄膜过滤，得无菌滤液。采用种子萌发和根长抑制法进行毒素生物活性测定。1.2.2 生物学活性测定1.2.2.1 病菌毒素对种子萌发的作用 选取饱满的小麦种子，用0.1%HgCl2进行表面消毒3min，然后用无菌水冲洗干净并用灭菌的滤纸将种子表面的水吸干。取直径9cm的培养皿，放入一张灭菌的滤纸，用5ml无菌滤液、1/4的稀释液、1/2的稀释液和2倍浓缩液的无菌滤液分别浸泡小麦种子，放置在（25±1）℃的培养箱中，3天后记载种子萌发率，以根长超过种子直径者计为萌发，计算种子萌发率和抑制率。抑制率（%）=（清水对照种子萌发率—处理种子萌发率）/清水对照种子萌发率×1001.2.2.2 病菌毒素对种子根生长的作用 选取饱满的小麦种子，加水浸泡12～24h时，倒掉水并用无菌水冲洗3遍后再放到25～26℃恒温条件下催芽。待主根长约2mm时，将种子胚向下摆在事先已铺有毒素浸湿的纱布（或滤纸）的培养皿内，再在种子上覆盖二层同样处理的滤纸，置25～26℃黑暗下培养48h，测定主根长度，并计算抑制百分率。1.2.2.3 病菌毒素滤液对小麦籽粒黑胚率和千粒重的影响 制备病菌孢子悬浮液（10×10倍显微镜下，20～30个孢子/视野）和粗毒素滤液，在扬花后5天、10天和15天分别喷洒到扬花前已套袋的小麦穗上，并在接种后再次套袋。选取3个感病品种和3个抗病品种，每品种每次接种20穗。收获后调查籽粒黑胚率及千粒重。1.2.3 病菌毒素的理化性质测定1.2.3.1 毒素粗提物中蛋白与非蛋白部分的活性测定 在培养滤液中加入2倍体积的甲醇，随后将该培养滤液于10℃下3000r/min离心20min，得到含蛋白质的沉淀（即蛋白部分）和不含蛋白质的上清液（即非蛋白部分）。用蒸馏水将蛋白部分稀释至原培养液体积，非蛋白部分用旋转蒸发仪于60℃下减压蒸发充分除去甲醇后，也用蒸馏水稀释至原培养液体积，分别检测其生物活性，每处理3次重复，以未经处理的培养滤液和清水为对照。1.2.3.2 毒素的酸碱稳定性测定 将毒素培养滤液的pH值用1mol/L NaOH和HCl分别调至3、4、5、6、7、8、9、10。于常温下放置24h后，再调回原值，在60℃水浴中浓缩至原体积，进行活性检测。每处理2次重复，以未经处理的培养滤液和清水为对照。1.2.3.3 毒素的热稳定性测定 将无菌滤液分别于60、80和100℃水浴中处理20min、30min、40min、50min和60min，或于121℃高压灭菌处理20min，用无菌蒸馏水补足损失水分后，检测其生物活性。每处理2次重复，以未经处理的无菌滤液和清水为对照。1.2.4 毒素提取物对小麦种子几种酶活性的影响 选取饱满的小麦种子，表面消毒后置于培养皿中，用浓缩2倍后的无菌滤液处理种子，分别在处理前，处理后3h、6h、12h、24h、36h和48h取样进行酶活测定。1.2.4.1 多酚氧化酶（PPO）提取与活性测定 称取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。加入2ml 0.02mol/L的磷酸缓冲液（pH6.8），于4℃下4000r/min离心15min，上清液即为PPO粗提液。取粗提液100μl，加入pH6.8磷酸缓冲液1.5ml，混匀后于30℃水浴中保温10min。然后加入0.02mol/L邻苯二酚1.5ml，立即计时，于分光光度计398nm下测其3min内OD变化值，以每分钟增加0.01个OD值定义为一个酶活性单位（U），对照为3ml的磷酸缓冲溶液。各样品均重复测定3次。1.2.4.2 过氧化物酶（POD）提取与活性测定 取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。加入2ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH6.0），于4℃下4000r/min离心15min，上清液即为POD粗提液。采用愈创木酚法，在470nm波长下测定吸光值，然后以每分钟每克鲜重OD值变化1.0所需的酶量为一个酶活单位（U），对照为3ml的磷酸缓冲液。各样品均重复测定3次。1.2.4.3 SOD酶活性测定 取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。取4ml的SOD反应液与小烧杯中，加入50μl酶提取液，在加200μl核黄素，混匀（以pH7.8磷酸缓冲液代替酶液作为对照）。在光下反应10min，黑暗终止反应，与560nm下测吸光值。测定结果表明，病菌培养滤液对种子萌发和小麦根系的生长都有明显的抑制作用。培养滤液原液种子根伸长抑制率高达90.18%，对种子萌发抑制率也达到65.0%。浓缩两倍的培养滤液对种子萌发抑制率高达100%，种子根生长抑制率达到99.27%。随着培养滤液浓度的降低，对种子萌发和根系生长抑制率也逐渐下降（表1）。培养滤液浓度平均种子萌发率（%）平均种子萌发抑制率（%）平均根长（cm）平均根长抑制率（%）培养滤液2倍浓缩液0e100.000.02c99.27培养滤液原液35.00d65.000.27c90.18培养滤液1/2稀释液70.00c30.001.18b57.09培养滤液1/4稀释液87.50b12.502.74a0.27清水对照100.00a—2.75a—表1 链格孢毒素培养滤液对小麦种子萌发和根系生长的影响利用病菌孢子悬浮液和病菌毒素滤液分别接种处理小麦穗部，在收获后统计籽粒黑胚率，结果发现病菌孢子悬浮液和病菌毒素滤液处理籽粒黑胚率均比清水对照显著提高，其中病菌孢子悬浮液接种黑胚率高于毒素滤液处理，且扬花后5天和10天接种病原菌发病较厉害。（表2）。处理处理时间（天）感病品种抗病品种漯麦4号豫农9901豫麦18豫麦47豫优1号科优1号CK（套袋）—2.41f3.77e2.35e2.87f0.78e0.79e毒素滤液扬花后5天3.00e6.28d4.24d6.78e2.13c0.95e扬花后10天4.81c15.61c8.53b10.44c2.71b1.51c扬花后15天3.85d6.63d2.82e9.57cd1.60d1.19d孢子悬浮液扬花后5天10.00a19.71a13.61a16.40b2.76b3.03a扬花后10天3.93d15.33c5.86c8.72d2.88b1.54bc扬花后15天6.69b18.28b7.80b18.42a4.36a1.76b表2 链格孢毒素滤液和孢子悬浮液处理后小麦籽粒黑胚率 （%）利用病原菌孢子悬浮液和毒素培养滤液分别处理6个小麦品种的麦穗，发现有些品种籽粒千粒重明显下降，损失率最高达到32.27%，与清水对照差异十分显著。而且，用毒素处理的小麦籽粒千粒重的影响还要大于接种病原菌孢子悬浮液的影响（表3）。处理处理时间（天）感病品种抗病品种漯麦4号豫农9901豫麦18豫麦47豫优1号科优1号CK（套袋）—48.17a47.85a48.28a48.03a47.57a42.32a毒素滤液扬花后5天46.70b36.65d42.83c32.53e41.33c35.37cd扬花后10天36.53c41.20b42.53c34.23d39.39d36.75c扬花后15天46.39b38.58cd40.55d35.01d33.72e33.83e孢子悬浮液扬花后5天46.79b40.11bc44.74b42.98c43.22b35.37cd扬花后10天47.11ab42.76b42.98c45.50b38.28d40.03b扬花后15天46.40b40.39bc41.39cd45.26b33.73e34.33e表3 链格孢毒素滤液和孢子悬浮液处理后千粒重2.4.1 病菌培养滤液中蛋白与非蛋白部分的活性测定 由实验结果可以看出，培养滤液中蛋白等大分子物质部分对种子萌发没有抑制作用说明该部分无致病活性，而非蛋白部分队种子萌发抑制率则与培养滤液原液相似，说明其保留了病原菌培养滤液的致病活性（表4）。处理滤液蛋白部分滤液非蛋白部分培养滤液原液清水对照平均种子萌发率（%）98.3a47.33b46.67b100.00a平均种子萌发抑制率（%）1.7052.6753.330表4 小麦黑胚链格孢代谢物中蛋白部分和非蛋白部分的活性2.4.2 毒素的酸碱稳定性 测定结果表明，用不同pH值处理链格孢培养滤液24h后，其生物活性几乎不受影响，对种子萌发的抑制率都达到50%以上，与培养滤液原液没有明显差异，说明小麦黑胚病链格孢毒素具有较强的酸碱稳定性（表5）。滤液pH值345678910原液清水对照平均种子萌发率（%）46.67b50.00b48.33b45.00b45.00b48.33b45.00b46.67b46.67b100.00a平均种子萌发抑制率（%）53.3350.0051.6755.0055.0051.6755.0053.3353.33—表5 不同pH处理后链格孢培养滤液对种子萌发的活性2.4.3 毒素的热稳定性 由表6可以看出，小麦黑胚病菌培养滤液于60、80和100℃水浴中处理20min、30min、40min、50min和60min处理后活性与没有处理的对照几乎没有差异，而且在121℃下处理20min仍不失活，说明其热稳定性较强。温度处理（℃）处理时间（min）203040506012158.33a———10050.00a51.67a51.67a51.67a51.67a8051.67a55.00a53.33a53.33a51.67a6050.00a53.33a51.67a50.00a51.67a常温55.00a50.00a51.67a50.00a51.67a表6 不同温度处理后链格孢培养滤液对种子萌发的抑制率 （%）链格孢毒素对小麦种子多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的影响见表7。测定结果表明，随着时间的延长，不论是感病品种还是抗病品种在毒素滤液处理后PPO、POD和SOD的活性均下降，且抗病品种较感病品种下降慢。从3种酶活性测定结果来看，SOD活性在毒素滤液处理后下降更为明显。时间（h）PPOPODSOD豫优1号豫农9901豫优1号豫农9901豫优1号豫农9901028.0031.8323.5022.17214.04181.61328.8326.1722.0020.67204.10143.82623.0024.0018.8319.33198.70136.381222.0022.8317.6718.67179.67124.482420.1719.3317.3317.67154.9894.263619.0017.6718.0016.33115.4589.734817.1716.5017.0016.83112.1192.06表7 毒素滤液处理对小麦种子酶活性的影响 （单位：U/min·g）初步研究结果表明，小麦黑胚病菌可以产生致病毒素，该毒素能够抑制小麦种子萌发和根的伸长，并能加重黑胚病的发生，而且能够降低籽粒千粒重，初步结果表明病菌的致病作用与其产生的毒素有关，但是其机制有待进一步研究。对毒素基本性质的研究是进行纯化的基础。虽然本实验研究的毒素是未经提存的粗毒素，但是能够揭示其一般的特性。本实验结果表明，小麦黑胚病链格孢毒素为非蛋白类物质，而且是一种热稳定性及酸碱稳定性均较高的物质。这为以后研究和利用毒素提供了理论依据。SOD、POD、PPO这三种酶是存在于膜系统中的一种抵御活性氧伤害的保护酶，寄主在与病原菌或毒素的相互识别斗争过程中，会产生高出正常水平的活性氧，干扰正常的代谢功能，在正常情况下，活性氧都保持在一个动态平衡状态[11～12]。毒素处理小麦种子之后PPO、POD、SOD的活性均降低，可能由于毒素造成了活性氧清除系统中这三种酶系统的破坏，活性氧过量积累，细胞受到伤害，从而也抑制了种子的萌发。小麦黑胚病菌链格孢毒素的致病作用可能是一个比较复杂的过程，除了本实验研究的几种酶的作用外，还需对其他一些相关酶、细胞膜透性、酚类代谢、氧化磷酸化、细胞器结构等很多理化机制和细胞学结构变化等进行深入研究。同时，也要加强对毒素纯化和结构分析等方面的工作，为进一步研究毒素的性质和作用机理奠定基础。