灰霉病是保护地蔬菜栽培中危害十分严重的病害，传统的化学防治造成了严重的农药残留和环境污染。应用微生物进行生物防治能够克服上述缺点，是一种安全、有效和环保的方法。本研究旨在从黄瓜植株内分离、筛选能够抑制灰霉病的拮抗细菌，并测定拮抗菌株在不同处理下对灰霉病的防治作用。主要结果如下：通过平板对峙培养筛选出8株对黄瓜灰霉病菌具有较强拮抗作用的细菌，再对这8株菌发酵滤液的抑菌活性进行测定，选出抑制效果最好的两个菌株B12和B13，抑制率分别为84.0%和81.8%。在离体叶片上，B12、B13发酵滤液对灰霉病菌的扩展均有较强的抑制作用，抑制率分别为83.2%和81.4%。两菌株活性产物可引起病原菌菌丝扭曲，菌丝膨大成串珠状分枝，顶端膨胀后细胞壁破裂，原生质外溢，产生溶菌作用。B12、B13发酵液对于灰霉病菌孢子的萌发具有强烈的抑制作用。在孢子萌发试验中，经B12、B13发酵液处理的孢子萌发率仅分别为5.5%和8.6%，滤液对孢子萌发的抑制效果与发酵液相近。将两菌的发酵滤液置于不同的温度和pH环境下处理，当温度在100℃以下、pH值在6～9时，滤液的抑菌效果表现出较强的稳定性。在温室试验中，两菌发酵液对灰霉病有较好的预防效果，B12、B13的保护防效分别为70.5% 和68.7%，治疗防效分别为51.2%和47.8%。

烟草青枯病是由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种细菌性病害，是烟草的一大毁灭性病害。此病主要分布于世界热带、亚热带及温带等湿热地区。我国烟草青枯病菌在长江以南发生居多，据报道，该病在多发病区旱地烟田的发病率为30%～50%。对烟草青枯病的防治，迄今仍无十分有效的措施，通常采用化学农药方法防治，但由于青枯病是维管束类病害，因而限制了化学农药的使用；而且化学防治易产生抗药性，造成环境污染。近年来，由于生物防治具有无污染、无公害、长效性等特点，所以青枯病的生物防治逐渐引起国内外的高度重视[1～4]。目前已取得了良好的进展，如魏春妹等[5]研制出番茄青枯病和烟草青枯病的生防制剂“青枯散”，田间试验证明该制剂对番茄青枯病、烟草青枯病有70%和80%的防治效果。为了筛选拮抗能力、定殖竞争能力强和效果稳定的优势菌株，本实验室从烟草的根标、根围土壤分离筛选出了拮抗细菌，并进行了室内拮抗能力的测定和盆栽烟苗防病的系列研究，得到了一株拮抗能力较好的菌株SH7，具有较好的商业化前景。本研究进行了SH7摇瓶发酵试验，筛选适合该菌株的发酵培养基配方和发酵条件。枯草芽孢杆菌SH7菌株由本室筛选、保存。种子培养基：牛肉汁液体培养基（酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、pH值7.0，定容至1L）。待测培养基的配制[6]：①号培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆粕1%；②号培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆粕1%、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1%；③号培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%；④号培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%、淀粉0.3%、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1%。将4种不同培养基pH值均调为7.2～7.3，装液量为60ml/300ml。121℃灭菌20min，备用。1.2.1 种子准备 牛肉汁液体培养基，pH值为7.0，装瓶量为100ml/300ml三角瓶，121℃灭菌20min。将牛肉汁液体培养基接菌后37℃过夜摇菌。1.2.2 培养基配方筛选 上述4种培养基中接种种子菌液1.5ml，在31℃条件下，摇菌36h后取5ml发酵完毕的菌液，在12000r/min下离心5min，倒掉上清，冷冻干燥沉淀18h后，称重量。1.2.3 发酵培养条件优化 每次只改变测定的一个发酵条件，其他方法同1.2.2。2 结果从表1可以看出，3次重复中5ml培养液中菌体干重的平均值大小依次为④号（0.0094g）＞③号（0.0089g）＞①号（0.0059g）＞②号（0.0054g），因此④号培养基较适合该菌的发酵。2.2.1 pH值 将发酵培养基的pH值分别调为7.0、7.3、7.6、7.9、8.2，3次重复。在装瓶量为60ml/300ml，接种量为1.5ml，31℃，180/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果为，pH值7.0为0.0081g、pH值7.3为0.0061g、pH值7.6为0.0079g、pH值7.9为0.0082g、pH值8.2为0.0092g。pH值8.2比较适合该菌的发酵（图1）。重量（g）①号②号③号④号10.00590.00510.00970.013120.00660.00530.00970.006230.00510.00380.00720.0090平均0.00590.00540.00890.0094表1 培养基配方筛选结果2.2.2 装瓶量 将发酵培养基的pH值分别调为8.2，接种量为1.5ml，在300ml的三角瓶中分别装入40ml、60ml、80ml、100ml、120ml，3次重复。在31℃、180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果为，40ml的为0.0065g、60ml的为0.0071g、80ml的为0.0065g、100ml的为0.0053g、120ml的为0.0062g。300ml的三角瓶中装60ml培养基较适合该菌生长（图2）。图1 pH值筛选结果图2 装瓶量筛选结果2.2.3 接种量 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量分别设为2%、4%、6%、8%、10%，3次重复。在31℃、180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果是，接种量2%的为0.0098g、4%的为0.0108g、6%的为0.0103g、8%的为0.0112g、10%的为0.0096g。较合适的接种量为8%（图3）。2.2.4 培养温度 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量为8%，将温度分别设为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃。在180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，25℃为0.0087g、28℃为0.0107g、31℃为0.0112g、34℃为0.0099g、37℃为0.0106g。较合适的温度为31℃（图4）。图3 接种量筛选结果图4 温度筛选结果2.2.5 培养转速 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量为8%，温度为31℃。将转速分别设为120r/min、150r/min、180r/min、210r/min、240r/min，摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，120r/min为0.0091g、150r/min为0.0109g、180r/min为0.0092g、210r/min为0.0107g、240r/min为0.0101g。150r/min比较适合该菌发酵，所以选定150r/min作为较适转速（图5）。2.2.6 发酵时间 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，将摇菌时间分别设为12h、24h、36h、48h、60h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，12h为0.0038g、24h为0.0062g、36h为0.0063g、48h为0.0067g、60h为0.0063g。发酵时间36h和60h菌体重量相同，但48h菌体重量最大，发酵时间越长对于生产越不经济，所以选取48h为较适发酵时间（图6）。图5 转速结果筛选图6 发酵时间筛选结果为了确定最优的培养基配方，我们将摇瓶试验结果相对较好的④号培养基作为基础培养基（培养基中其他营养成分不变），从中选出4种主要成分，采用优化好的发酵条件，按正交设计表L9（34）设计了4个因素、3个水平的正交试验，以进一步优化培养基配比[7，8]。正交试验设计和结果见表2。由表中R值可看出，影响SH7菌量依次为：牛肉膏＞蛋白胨＞NaCl＞葡萄糖。正交试验结果表明最佳培养基组合为：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl。试验号牛肉膏（%）蛋白胨（%）葡萄糖（%）NaCl（%）菌体含量（g/5ml）1号1（0.3%）1（1%）1（1%）1（0.5%）0.009112号12（1.5%）2（1.5%）2（0.8%）0.010563号13（2%）3（2%）3（1.1%）0.011784号2（0.6%）1230.011445号22310.012566号23120.011897号3（0.9%）1320.011228号32130.012679号33210.01233Ⅰj0.03145g0.03177g0.03367g0.03400gⅡj0.03589g0.03579g0.03433g0.03367gⅢj0.03622g0.03600g0.03556g0.03589gR0.00477g0.00423g0.00189g0.00222g表2 正交试验设计及结果本文通过对该菌培养基配方和培养条件的优化选择以及正交试验，初步确定最适宜SH7菌株生长的培养基配方及培养条件如下：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl；发酵起始pH值为8.2、300ml的三角瓶装瓶量为60ml、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，发酵时间为48h。这为SH7菌株的发酵罐放大试验提供了理论依据。本试验采用渐进法优化发酵条件，每确定一项，就在下一目标筛选中应用，这样使得得到的试验结果更准确。同时也要考虑到实际生产中的成本问题，例如某些营养物质含量不能太高或发酵周期不能过长，否则成本就会升高。众所周知，烟草业在国民经济中占有重要地位，目前青枯病的化学防治和生防都不甚理想，一定程度上制约了我国的烟草生产和出口。本实验室所筛选出的芽孢杆菌SH7对烟草青枯病菌表现出了良好的拮抗性，温室药效试验达到了较高的水平，前景广阔。本试验筛选出了适合该菌的发酵配方并优化了发酵条件，为该菌的生产应用打下了良好的基础。

Rice stripe(RSV)has been known to distribute in rice areas all over the world,and it is very hard virus,transmitted by insect vectors,small brown planthopper(SBPH),Laodelphax striatellus,Fallen.Once the rice is infested,there is still no very effective measures to control,even the chemicals.The chemicals'effect is not ideal and more or less they could cause some environmental risks,so there is the common opinion in the IPM system that the rice varieties having resistance to rice stripe is one of the basic and effective measures to control this disease.In 2006 and 2007 for finding the resistant rice varieties that could be used for large scale in the field,the evaluation and screening of rice varieties were conducted in Jiaxing,Zhejiang Province.In 2006,there were 40 varieties provided for the experiement,just like Chunjiang 050,Xiushui 63,Y1,Zheda 510,Tai 03126,HZ586 and so on,and Jia 991 was set to be the control.Similar to 2006 studies,in 2007,there were 20 varieties used in 2006,and newly introduced into 17 varieties,just like Leyou 2,Jiaheyou 261,Bing 04～123,Jiashao 3.The control was still Jia 991.In 2006,the experiment was conducted in the yard of Shuangqiao Academic of Agricultural Science,Xiuzhou,Jiaxing.Last year in this plot rice was planted,and in winter no crop was planted.The water and fertilizer condition was good.The rice was seeded in 2th June,and transplanted to the field in 1st July.Randomed blocking design,and the size of every plot is 30m2,with three replications.The field management was as usual,except for no chemicals use for controlling the SBPH and RSV.In 2007,the experimental field was chose to north suburb of Jiaxing,where last year the RSV occurred hard.The experimental field condition and design were familiar with 2006,and total 111plots.Investigated Methods In 2006,after 5d from 1st July when the rice were transplanted,the investigation was conducted every 5d in field,till the diseases was stable,at that time the total rice tiller and the diseased tiller amount were recorded.Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield(%)SSRP=0.05P=0.011Jiahe2156.03aA2Y25.33bB3Jiajing36485.24bB4Y33.9cC5Shaojing04-463.49dD6Jia991(CK)3.07eE7Yongjing04683.02efEF8Y62.88fgEFG9Tai04-42.83gFG10Xiushui032.73ghGH11Qianghu9142.73ghGH12Y102.59hiHI1336You7482.52ijHI14Xiushui092.51ijHI15ZH2512.42jkIJ16Xiushui1102.27klJK17Jingzhi202.27klJK18Y42.23lmJKL19Jia04-332.14lmnKLM20Jiahua12.11mnKLM21Xiushui632.04nLM22Jiahe2182nM23Zheda5101.99nM24Bing01-1131.74oN25R41011.69oN26Y51.59oN27Jingzhi270.94pO28Chunjiang0500.91pO29Chunjiang0510.91pO30Bing03-1230.88pO31Jiaheyou28880.87pO32Zheda5320.86pO33Y80.86pO34Y10.81pO35Ning04-450.45qP36Tai031260.44qP37HZ5860rR38Y70rR39Y90rR40JiaheyouTR0rRTable 1In 2007,after 15th May,when the seeds were seminated,the investigation was conducted periodically in seedling stage till 20th June,when the rice was transplanted,the total rice tiller and the diseased tiller amount were recorded.And in field,30th July,when the disease was stable,the same indexes were recorded.By the total rice tiller and the diseased tiller amount,the disease percentage could be got,and by DPS software the resistance of different rice varieties could be made with ANOVA method.From table 1,we could get that in 2006 the RSV occurred softly in the experimental field,the CK,Jia 991'disease percentage was just 3.07%.Shaonuo 04~46,Y3,Jiajing 3648,Y2,Jiahe 215's were higher than CK;but there were four varieties,Jiaheyou TR,Y9,Y7,HZ586,which no typical RSV was found.By ANOVA analysis,the resisstance of rice varieties were obviously different.Jiaheyou TR,Y9,Y7,HZ586,which no typical RSV was found,the resistance were the highest;the Yongjing 0468,Y6 and CK were in the same level and at P=0.01 there were no obvious difference;and Shaonuo 04～46,Y3,Jiajing 3648,Y2,Jiahe 215 resistance were weak.In 2007,in the field the RSV occurred seriously in the experimental field,the CK,Jia 991'disease percentage was 19.12%(Table 2).Disease percentage of Shi 1 and Yongjing 0468 were 27.8%and 25.65%,respectively;there were 16 varieties,for example Jia 991,the disease percentage were above 10%;and the disease percentage of HZ586,Chunjiang 051,Jiahe 218,Jiaheyou 555 and Y9 were below 2%.By ANOVA analysis,the resistance of these rice varieties were seriously different.Disease percentage of Shi 1 and Yongjing 0468 were obviously higher than CK,their resistance were weak;the disease percentage of HZ586,Chunjiang 051,Jiahe 218,Jiaheyou 555 and Y9 were far below from other variety,their resistance were high;and others resistance were in the middle level.In 2007,in the seedling field the disease percentage of Bing 04～132,Zheda532,Xiushui 09,Xiuishui 110 and Bing 05～15 were all above 5%;the disease percentage of was just 0.07%,and in the Chunjiang 051 there was no RSV found;Other varieties percentage of disease were in the middle of 5%and 0.07%(Table 2).Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield(%)SSRP=0.05P=0.01VarietiesDiseasepercentageintheseedlingfield(%)SSRP=0.05P=0.011Shi127.8aABing04-1325.68aA2Yongjing046825.65aAZheda5325.6aA3Bing04-0819.62bBXiushui095.39aAB4Jia991(CK)19.12bBXiushui335.24abAB5Xiushui11018.5bBXiushui1104.85abcABCTable 2 Evaluation of rice varieties resistance to RSV (Jiaxing, 2007)Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield（%）SSRP=0.05P=0.01VarietiesDiseasepercentageintheseedlingfield（%）SSRP=0.05P=0.016Bing05-1517.83bBCShi14.34abcdABCD7Bing01-11317.76bcBCJiahua14.34abcdABCD8Y517.33bcBCYongjing04684.24abcdABCDE9Jiahua116.5bcdBCBing05-154.15abcdeABCDEF10Xiushui3316.4bcdBCY53.78abcdefABCDEFG11Ning04-4516.26bcdBCBing04-083.66abcdefgABCDEFGH12Bing04-13215.75bcdBCJia991（CK）2.9bcdefghABCDEFGHI13Zheda53215.69bcdBCY22.88bcdefghABCDEFGHI14Y215.18bcdBCDBing01-1132.81bcdefghiABCDEFGHI15Shi215.06bcdBCDNing04-452.77cdefghijABCDEFGHI16Xiushui0914.99bcdBCDY12.66cdefghijABCDEFGHI17Y112.96cdeBCDEQianghu1712.52cdefghijkABCDEFGHI18Qianghu17112defCDEBing05-1142.48cdefghijkABCDEFGHI19Bing03-019.22efgDEFShi22.26defghijkBCDEFGHI20Bing04-1138.25fghEFGBing03-012.14defghijkBCDEFGHI21Jiaheyou6127.18ghiEFGHBing04-1131.69efghijkCDEFGHI22Bing03-1235.76ghijFGHJiaheyou2611.39fghijkDEFGHI23Leyou25.42ghijFGHJiaheyou6121.23ghijkDEFGHI24Jiaheyou2615.23ghijFGHBing03-1231.11hijkDEFGHI25Jiaheyou16204.76ghijFGHY71hijkEFGHI26Shaonuo04-464.36hijFGHChunjiang0500.99hijkEFGHI27Jiashao34.3hijFGHJiahe2180.94hijkFGHI28Chunjiang0503.22ijFGHLeyou20.9hijkFGHI29Y73.18ijFGHJiaheyou62230.72hijkGHI30Jiaheyou62233.1ijFGHJiaheyou5550.7hijkGHI31台031262.97ijFGHJiaheyou16200.5hijkGHI32Bing05-1142.9ijFGHY90.38hijkHI33HZ5861.83jGHHZ5860.32ijkI34Chunjiang0511.81jGHShaonuo04-460.24jkI35Jiahe2181.78jGHJiashao30.24jkI36Jiaheyou5551.53jHTai031260.07kI37Y90.94jHChunjiang0510kI续表2By ANOVA analysis,the different resistance of these rice varieties also existed.the disease percentage of Bing 04～132,Zheda532 and Xiushui 09 were higher,and their resistance were weak;the disease percentage of six varieties,Chunjiang 051,Tai 03126,HZ586,Shaonuo 04～46,Jiashao 3 and Y9,were lower,and they had comparatively high resistance.Through the rice varieties screening for resistance to rice stripe virus(RSV)in the seedlingstage and in the field in Jiaxing,in 2006 and 2007,the difference of rice varieties resistance to RSV could be found,and the resistance trends between different developmental stage and different year kept in the same trends.Chunjiang 051,Y9,Jiahe218,Jiaheyou 555,Tai 03126 and Bing 03~123,and so on,had the high resistance to RSV.Though most of the results showed that the varieties resistance behave the same in different developmental stage and different year,we also should notice that few varieties did not obey this trends,for example,Shaonuo04～46,in 2006 in the field it showed very weak resistance,but in 2007 in the seedling field it showed high resistance.This perhaps tell us that just use the index of disease percentage is not enough,and at the same time we could ignore that there is still no very clear criterion to evaluate the varieties resistance to RSV.These factors could influence our evaluation.In 2006 the RSV occurred softly in the experimental field,the CK,Jia 991 disease percentage was just 3.07%,but in 2007 the CK,Jia 991's disease percentage was 19.12%,far higher than that in 2006.That is because in 2007 we chose the field where in year before the RSV occurred seriously,and advanced the seeding date and transplanted date accordingly,which the two steps could make the optimal RSV occurring conditions.On other hands,in the same cultivated condition,the disease percentage different varieties could behave 10-folder difference,it could show us clearly that the varieties resistance could exert important role in the RSV IPM system.Research was funded by a grant from Zhejiang province Science and Technology Bureau.

正向（经典）遗传学是通过生物的表型来推测其遗传物质的组成、分布和传递规律等，而反向遗传学是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论和技术，通过核苷酸序列的定点突变、缺失和插入等创造突变体并研究突变所造成的表型效应。随着基因组测序技术、侵染性克隆的构建技术、定点突变技术和报告基因的使用等，反向遗传学技术在研究植物病毒基因功能、侵染过程和致病机理等方面的应用越来越广泛。本文报道了该技术在研究马铃薯Y病毒（PVY）HC-Pro和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）P22功能方面的部分结果。PVY HC-Pro基因由本实验室提供，SPCSV的有关基因由芬兰赫尔辛基大学Valkonen教授提供，PVX201质粒由Baulcombe教授提供。突变试剂盒（Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）购自STRATAGENE公司，大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存，PCR突变引物由赛百盛公司合成。Figure 1 Symptoms of Nicotiana benthamiana plants inoculated with different constructs based on PVX 201将SPCSV P22、P28和RNaseIII等基因克隆到PVX201载体上，根据接种后出现的症状判断哪个基因能增强PVX对本氏烟的致病力。将PVY HC-Pro克隆到PVX201载体上，针对HC-Pro的KITC和IGN等位点设计合适的突变引物，参考突变试剂盒（Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）说明进行突变。通过测序证实所得突变体的准确性。大量提取法提取质粒PVX201、PVXHC或相应的突变体，摩擦法接种本氏烟（Nicotiana benthamiana），观察所致症状的差别。PVX201载体在本氏烟上引起轻微的斑驳和褪绿花叶症状，但不引起植株的死亡。SPCSV P28和RNase III等基因连接到PVX201后对症状无影响，但P22能提高PVX对本氏烟的致病力，导致了接种植株的死亡，说明P22是致病性的增强子。携带P22的PVX（PVX-p22）首先在接种叶上引起坏死斑点。坏死斑点扩展后，沿着叶脉到达茎部，引起上部组织坏死，最终导致本氏烟整株枯死。RNA沉默抑制因子HC-Pro也能提高PVX对本氏烟的致病力。表达HC-Pro的PVX（PVX-HC）在接种后7天出现严重明脉和卷曲，10～14天时首先心叶出现坏死，随后整株萎蔫死亡。但在接种叶上没有坏死斑，看不到明显的扩展迹象。KITC是HC-Pro的一个重要基序，参与病毒的蚜虫传毒、协生和抑制RNA沉默等过程。我们在测定烟草脉带花叶病毒（TVBMV）全基因组序列时发现，TVBMV（YND分离物）HC-Pro KITC基序中的K变成了R，而且也有蚜虫传毒活性。我们把PVY HC-Pro的KITC突变成RITC后，再接种本氏烟，发现该突变仍能引起本氏烟植株的死亡。把K突变为A（突变体1，K52A）后，突变体也能引起本氏烟死亡，说明HC-Pro KITC基序中的K可能不参与和PVX的协生。但把KITC基序中的C缺失后（突变体2，C55Del）就不能引起植株死亡，说明KITC基序中的C对于协生作用是不可缺少的。对于HC-Pro其他突变体的功能分析正在进行中。

沃尔巴克氏体（Wolbachia）是自然界中分布非常广泛的胞内共生菌之一，近10余年的研究表明，这类共生菌广泛存在于各类昆虫体内，甚至估计16%的昆虫均含有该菌[1]。对来自33个不同寄主的38个不同Wolbachia株系的ftsZ基因（细胞周期基因）研究表明，Wolbachia 株系间存在着很大的差异，Wolbachia 株系分为A组群和B组群[2]。Zhou等在wsp（编码Wolbachia表面蛋白）基因序列分析的基础上，将沃尔巴克氏体细分为12个亚群（Subgroup），并设计了12个亚群wsp基因诊断的PCR扩增特异引物[2]。昆虫体内是否含有Wolbachia，早期多通过DAPI染色法（用非特异性的DNA-blinding荧光染料DAPI染色，然后在荧光显微镜下观察）[4]和电镜观察[5]来判断，但20世纪90年代以来则主要依赖于对其16S rDNA、23S rDNA、ftsZ 和wsp等基因进行PCR检测与序列分析，其中wsp基因是目前报道的Wolbachia基因中进化最快的基因而被广泛用于Wolbachia的PCR检测与分子鉴别[1，3，6，7]。沃尔巴克氏体通过卵的细胞质传播并参与多种调控其寄主生殖活动的机制，包括诱导孤雌生殖（Parthenogenesis inducing，PI）[8]、雌性化Feminzation）[9]和生殖不亲和[10]，因而它很有希望被用于许多虫媒传播的重大人类疾病的基因工程防治和生物防治。灰飞虱（Laodelphax striatellus Falln）广泛分布于东亚、东南亚、欧洲和北非等地，我国以长江中下游和华北地区发生较多。灰飞虱能取食或为害水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、稗草、李氏禾等多种禾本科植物，并且能传播多种病毒病，造成病害的普遍流行。因此，进行灰飞虱种群暴发成灾规律及其有效防治技术的研究，显得尤其重要和紧迫。本文采用PCR方法研究了灰飞虱体内Wolbachia的感染，以期为开辟控制灰飞虱暴发和阻断病毒病传播新途径提供依据。从河北省曲阳和容城小麦田采集灰飞虱成虫，保存在小麦苗上。每只灰飞虱为1个样本，放入离心管中冷冻，而后置于载玻片上，呈直线逐步滴1滴Ringer's solution（昆虫生理盐水），去头，放入装有预冷100μl STE 的管中，匀浆，10%SDS 5μl及蛋白酶K 2.5μl，55℃水浴1h，加酚50μl及50μl氯仿：异戊醇（24：1），剧烈震荡，12000r/min 离心5min。取上清，加入2倍体积无水乙醇及0.1体积3mol/L NaAc，-20℃沉淀过夜，离心，12000r/min。弃上清，加75%乙醇200μl洗涤2遍。55℃烘干，加入30μl无菌水溶解，-20℃冻存，待检。扩增wsp基因片段使用的引物[3]：wsp 81F(5'TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC3')wsp 691R(5'AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3').在20μl反应体积中进行PCR反应，反应体系为13.5μl ddH2O，2μl 10×Buffer，2μl 25 mmol/L MgCl2，0.5μl dNTPs（每种10mmol/L），0.5μl 20μmol/L的正向和反向引物及一个单位的Taq高温多聚酶。Taq plus及dNTP购自上海生工生物工程公司。PCR反应条件是：首先在94℃下变性3min，然后94℃下1min，55℃下1min，72℃下1min完成1个循环，共进行35次循环。72℃末轮聚合10min。反应结束后取PCR特异性扩增产物5μl，在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳（电压40V，50min，电泳缓冲液为0.5×TBE），用BioRad凝胶成像系统检测并拍照。选择有扩增产物的样品进行大量PCR扩增，采用PCR产物回收试剂盒（上海生工生物公司产品）回收PCR扩增产物交上海生工生物工程公司进行测序，利用BLAST工具（NCBI网站）进行DNA序列检索和同源性比较。采用wsp基因通用引物81F和691R对灰飞虱DNA样品进行PCR扩增，电泳检测结果表明从灰飞虱DNA样品中可扩增出600bp大小的wsp目的基因片段，证实河北曲阳和容城田间采集的灰飞虱种群有Wolbachia 的感染（图1）。河北曲阳和容城灰飞虱种群的沃尔巴克氏体感染率分别为85.6%和88.4%，而且雌雄个体感染率无差别。将扩增的wsp基因片段进行基因序列测定，结果表明，从所检测的样品中扩增出的Wolbachia的wsp基因片段长度为601～603bp。用NCBI网站提供的BLAST分析工具进行基因序列同源性分析，表明灰飞虱体内感染的Wolbachia wsp基因与Wolbachia pipientis 的wFur、wStri 2个品系的wsp基因的同源性为100%，与Wolbachia sp.的wJapo、wFur、wStri 3个品系的wsp基因的同源性也达到100%（表1）。图1 灰飞虱体内沃尔巴克氏体wsp基因片段的扩增Wolbachia品系同源性注册号宿主来源WolbachiapipientisisolatewFur100%AF481185.1白背飞虱Kittayapong等，2003WolbachiapipientisisolatewStri100%AF481175.1灰飞虱Kittayapong等，2003Wolbachiasp.Wstri100%AF020080.1灰飞虱Zhou等，1998Wolbachiasp.wJapo100%AB039283.1ElenchusjaponicusNoda等，2001Wolbachiasp.wFur100%AB039043.1白背飞虱Noda等，2001Wolbachiasp.Wstri100%AB039042.1灰飞虱Noda等，2001表1 灰飞虱感染Wolbachia的wsp基因序列的同源性Wolbachia是自然界分布较广的共生菌，在双翅目、膜翅目和鳞翅目等许多昆虫体内均有感染。甘波谊等以PCR方法检测了来自不同地域稻田的3种稻飞虱，发现灰飞虱、褐飞虱（Nilaparvata lugens）、白背飞虱（Sogatella furciera）均被Wolbachia所感染，对wsp的RFLP分析证实了这些飞虱为单一沃尔巴克氏体感染[11]。但不同地区灰飞虱体内沃尔巴克氏体的感染率不同，在我国形成了周边地区感染率高（如辽宁、北京、上海和云南），而内陆地区感染率低（如四川），或是未被感染（如宁夏）的格局[11]。在日本采集的9个灰飞虱种群被Wolbachia感染的比率随纬度降低而增加[12]。这些不同可能与不同地区的地形、气候、寄主条件及Wolbachia的传播效率等因素有关，其原因有待研究证实。本文研究结果表明，河北曲阳和容城灰飞虱种群沃尔巴克氏体感染率较高，与前人的报道一致。通过对基因序列的同源性分析表明，河北的2个灰飞虱种群感染的Wolbachia与来自白背飞虱的wFur品系、灰飞虱的wStri品系亲缘关系较近，同属于Wolbachia B大组Con组。这些表明灰飞虱可能会被同一组的Wolbachia感染。灰飞虱是多种病毒的传播介体，灰飞虱的暴发流行常造成玉米粗缩病、水稻条纹叶枯病等病毒病的严重流行。沃尔巴克氏体是灰飞虱的胞内共生菌，能够通过多种机制调控其寄主的生殖活动[13]，但是，近年灰飞虱种群暴发成灾与Wolbachia 感染的关系有待进一步研究证实。同时，沃尔巴克氏体影响灰飞虱传毒能力的作用及利用媒介昆虫—共生菌技术阻断病毒的传播将是今后研究的重点，对于开辟病毒病防治新途径具有重要的意义。

洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。1949年美国植物病理学家Burkholder首次发现B.cepacia可以引起洋葱酸皮病[1]。随后在20世纪50年代人们从第一例由B.cepacia引起的心内膜炎开始，发现该菌广泛存在于医院，并且可以使人类患上多种疾病，尤其是囊性肺纤维化（Cystic fibrosis，简称CF）病人的易感细菌之一，严重的会因此患“洋葱伯克霍尔德菌综合症”致死。最近研究表明，该菌致人死亡的一个原因要归咎于它含有脂多糖（Lipopolysaccharide）分子[2]。在进行医学研究的同时，发现该菌在工业和农业上有生物降解、生物防治等功效，对农业生产和环境保护起着重要的作用，具有广泛的应用前景。近年来，随着细菌分类技术的发展，洋葱伯克霍尔德菌已不仅只是作为一个种，而是一组基因型不同、表型相近的复合物，称为洋葱伯克霍尔德菌复合型（Burkholderia cepacia complex，简称Bcc）[3]。本文将在农业、分类地位等方面对Bcc的研究进展做一综述，以达到全面了解该菌的目的。人类第一次发现伯克霍尔德菌是由于它导致了洋葱酸皮病，该病菌主要分布在土壤和灌溉水中，在洋葱鳞茎形成后，从其因收割等原因造成的伤口侵入，或者是黏在叶部的菌被水冲刷进入组织内引起鳞茎腐烂。Ulrich在1975年研究表明[1]，该病原菌在低pH值环境下可以产生一种内多聚半乳糖醛酸酶，使洋葱组织软化，利于病原菌的入侵和扩展。后来郭道森等人研究表明，该菌与松材线虫共同侵染黑松和马尾松，导致松林大面积死亡[4]，在后续的研究中发现，松材线虫的分泌物及死虫体均可促进该菌株的生长繁殖和致病作用，且活线虫的促进作用比死虫体更加显著，这可能是由于松材线虫提供给该菌株某些重要的营养物质[5]。2005年，意大利西西里东部地区种植的天堂鸟（Strelitzia reginae Aiton）幼苗（苗龄2～3个月）发生新病害，鉴定发现致病菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli），这是关于该菌导致天堂鸟叶斑病及枯萎病的首次报道。在植物体上广泛存在着一些细菌，它们都具有诱发植物体内水分结冰的作用，称为冰核细菌。在没有冰核细菌存在的植物能耐-7～-8℃的低温而不发生霜冻，但是在一些B.cepacia 细菌存在的情况下，同样条件的植物在-2～-3℃可诱发多种植物细胞水结冰而发生霜冻。张耀东等从菠菜上分离到一株具有冰核活性的Bcc菌株[6]。1.3.1 对有毒物质的降解 一些工业排放物中含有大量的有害芳香烃类物质，随着工业化进程的加快，残留于自然环境中的芳香烃类物质含量急剧增加，如何解决这类物质造成的危害，成为研究者要解决的问题，而利用微生物降解是消除其危害的重要途径之一。洋葱伯克霍尔德菌可以利用多种物质为唯一碳源，这意味着其能够以土壤和地下水污染的有毒且难降解的物质（邻苯二甲酸盐、除草剂和氯代烃类化合物等）为碳源并将其降解[7]。例如，Bcc的一个菌株G4可通过由苯酚诱导的芳香族途径将三氯乙烯降解，由于苯酚是环境优先污染物之一，因而不宜被推广使用；但该菌株的突变体G45223 PR1可以不利用任何诱导物而直接降解三氯乙烯[8]。另外，许多芳香烃化合物在降解过程中都会形成中间产物邻苯二酚，细菌可以通过邻位裂解和间位裂解两种途径继续降解邻苯二酚[9]。刘涛等[10]从炼油厂废水中分离筛选到一株苯酚高效降解的洋葱伯克霍尔德菌L68，该菌株可产生邻苯二酚2，3-双加氧酶[11]，而邻苯二酚2，3-双加氧酶是降解芳香族化合物的关键酶，在间位降解途径中，该酶可以催化邻苯二酚的苯环裂解，转化为2-羟黏糠酸半醛。因此，洋葱伯克霍尔德菌对消除芳香烃类化合物的污染具有重要作用。另外，洋葱伯克霍尔德菌对化学农药也有很强的降解作用。如，Sarfraz Hussain 等人研究发现，在pH值为8.0，温度为30℃时，该菌对α-硫丹和β-硫丹的降解率达90%以上，从而减少了杀虫剂硫丹（Endosulfan）对土壤和地下水的污染[12]。1.3.2 对油脂的降解 洋葱伯克霍尔德菌降解油脂的特性在国外已有研究，Pooja Rathi，Hustavova等人报道了该菌产脂肪酶应用于催化酯化水解反应等研究[13]，洋葱伯克霍尔德菌能在降解利用油脂的同时还分泌出一定量的胞外脂肪酶，同时通过所产生的脂肪酶等降解酶系作用于油脂，将其分解氧化为低级脂肪酸、甘油、醇类等低分子有机物，最后降解为H2O、CO2等代谢产物[14]。徐保成[15]等人对该菌所需的降解工艺条件进行优化研究，结果表明在优化的油脂降解条件下（pH值7.0，30℃，溶解氧3.0mg/L），处理初始油脂浓度1000mg/L废水，24h后其油脂降解率达到90%以上，COD（Chemical Oxygen Demand）去除达到92%。B.cepacia产生的脂酶可以催化拆分外消旋化学农药，使其变为光学活性农药，从而成倍地提高了药效，而且减轻了生物体内的积累与毒副作用，避免了不必要的环境污染[16]。洋葱伯克霍尔德菌可以防治多种植物病害，如从樱桃果实表面和伤口上分离获得的洋葱伯克霍尔德菌对甜樱桃褐腐病表现出显著的抑制效果[17]；郑维等从堆肥样本中分离的洋葱伯克霍尔德菌株CF-66具有广谱抗菌活性，并初步鉴定该菌属于洋葱伯克霍尔德菌基因型Ⅴ[18]；李纪顺等对伯克霍尔德菌B418进行了研究，表明该菌对小麦纹枯病、小麦全蚀病和番茄南方根结线虫病有很好的防治效果[19]。陈京元等从湿地松苗根际分离得到1株B.cepacia C23菌株，对引起湿地松猝倒病的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、链格孢菌（Alternaria alternata）有明显的抑制效果。洋葱伯克霍尔德菌的防病机制主要为其能产生多种具有抗菌活性的代谢产物，如铁载体（Pyochenlin、Pyoverdine）、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、Cepaciamide A（B）、Cepacidine A（B）、Cepacin A（B）；菌株H111 能够有效杀死线虫Caenorhabditis elegans，其作用机理主要是由该细菌产生的细胞外毒素所致死[20]。B.cepacia AMMDR1可以抑制由瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）和根腐丝囊菌（Aphanomyces euteiches）引起的豌豆和甜玉米苗猝倒病，作用机理主要是该菌抑制游动芽孢的裂解，阻止孢囊的萌发而影响病原菌的生长[21]。在不断的研究中发现，该菌可以与杀菌剂共同使用，如I.Omar等人发现，在对大豆根腐霉病菌（Fusarium oxysporum）引起的番茄冠根腐病的研究中，B.cepacia菌株C91与低浓度杀菌剂混合使用，相比单独使用高浓度杀菌剂，杀菌效果提高了20%[22]。这不但减少了杀菌剂的使用，同时减少了杀菌剂对环境的污染。美国环保署（EPA）已经批准了两种以洋葱伯克霍尔德菌为主要成分的生防菌剂的生产，其商品名为Deny和Intercept，Deny用于防止Rhizoctonia spp.、Pythium spp.、Fusarium spp.和线虫引起的病害，而Intercept则用于防治Rhizoctonia solani、Fusarium spp.、Pythium spp.引起的病害[23]。具有拮抗作用的细菌往往与植物的生长有很大的关系，这些细菌都可产生一些抑制真菌生长的物质，如：铁载体（Siderophores），细胞溶酶的分泌物，抗生素等。对真菌生长的抑制就可以直接促使植物生长[24]。B.cepacia可以产生铁载体，一方面根际促生菌铁载体的产生很快耗尽了病原菌生存所需要的铁，从而使病原菌的繁衍和侵染能力大大下降；另一方面根际促生菌通过铁载体向植物提供铁营养，从而使植物获益[25]；另外，B.cepacia还可以产生抗生素有效地抑制周围其他微生物的繁衍。同时，B.cepacia的一些菌株具有固氮和产生吲哚乙酸（IAA）的作用，有助于植物对营养物质的吸收[26]。Bcc菌株具有较强的溶解磷酸盐的能力，推动植物对释放的磷的吸收，促进植物生长，Babu-Khan等克隆到其溶解磷酸盐的基因[27]。另一方面其通过对病原微生物的生物防治，减轻或抑制有害的根围微生物，从而间接的促进植物生长。例如，玉米种子被Bcc菌株MCI7包衣后，其植株感染病原镰刀菌的几率大大降低，且植株鲜重和株高均显著增加[28]。B.cepacia 原名Pseudomonas cepacia，1950 年首次被Burkholder报道可引起洋葱酸皮病[29]。该菌的其他名字还包括eugonic oxidizers group 1，Pseudomonas kingii和Pseudomonasmultivorans[30]，但是相关研究明确指出这些命名是P.cepacia的同义词，而且P.cepacia具有命名的优先权[31]。因此，这些命名没有被写入细菌手册，直到1981年，Palleroni 和Holmes才重新找到依据区分这些命名的不同[32]。1992年Yabuuchi 等正式将该菌及其他6个属于rRNAⅡ群的假单胞菌（P.solanacearum，P.pickettii，P.gladioli，P.mallei，P.pseudomallei 和P.caryophylli）归为一个新属，即伯克霍尔德菌属（Burkholderia）。与Pseudomonas属不同的是，该属被归为变形菌门（Proteobacteria）[33]。当Burkholderia属的分类地位被确定以后，该属已包括超过30个不同的种：B.cepacia（典型种），B.caryophylli，B.mallei，B.pseudomallei，B.gladioli，B.plantarii，B.glumae，B.vietnamiensis，B.andropogonis，B.multivorans，B.glathei，B.pyrrocinia，B.thailandensis，B.graminis，B.phenazinium，B.caribensis，B.kururiensis，B.ubonensis，B.caledonica，B.fungorum，B.stabilis，B.ambifaria，B.hospital，B.terricola，B.sacchari，B.tropicalis，B.brasilensis，B.anthina，B.dolosa，B.cenocepacia，B.xenovorans，B.tuberum，B.phymatum。通过研究得知B.caryophylli，B plantarii，B.glumae，B.andropogonis是植物的致病病原菌，能够使不同种属的植物患上根腐、叶斑、条斑等病害。在不同植物中分离得到的B.vietnamiensis，B.kururiensis，B.tropicalis，B.brasilensis，B.tuberum，B.phymatum，B.caribensis有促进根瘤形成，增强固氮的能力，同时促进植物根的生长。B.mallei和 B.pseudomallei则能够引起人和动物的鼻疽病。对于B.glathei，B.graminis，B.phenazinium，B.caribensis，B.caledonica，B.hospital，B.terricola，B.sacchari在环境、生态中所起的作用还不是很清楚。同时，还有一些具有多重作用，可以是植物致病菌，植物有益菌或是人类的机会致病菌，例如：Burkholderia cepacia complex，Burkholderia gladioli 和 Burkholderia fungorum[34]。从20世纪90年代中期开始，一些研究者发现来源于各种环境的Bcc分离物具有明显的遗传异质性，1996年，有报道说利用分子鉴定和临床观察，发现伯克霍尔德菌至少有3个不同的基因型是CF病症的致病菌[35]。直到1997年，Vandamme等运用多相分类研究方法对从CF病人中分离到的致病菌进行研究，才发现所设定的B.cepacia种中，至少存在5种不同的基因型[36]。包括B.vietnamiensis（基因型V）、B.multivorans（基因型II）、基因型I，III和 IV。这5种基因型被统称为伯克霍尔德菌复合型（B.cepacia complex）。利用不同的方法从医学和环境微生物的角度对伯克霍尔德菌复合型进行了探索研究，其中包括使用不同的选择性培养基。结果发现，农业研究中利用的培养基，能从土壤和植物根际附近发现大量的伯克霍尔德菌复合型的族群[37]；在医学研究中，几乎无法从自然界中发现伯克霍尔德菌复合型的存在[38]。直到伯克霍尔德菌分类的又一次改变，才使这些固有的不同有机的联系起来，一些研究者发现基因型IV与Bcc中的其他基因型有明显的差异，于是被归类B.stabilis[39]。接着从美国和英国的CF致病菌中分离出基因型VI，它除了与B.multivorans没有差异外，与其他基因型均有差异[40]。从人类致病菌与环境中都能分离B.ambifaria（基因型VII），因此它也具有生防菌的特征。最近，发现B.pyrrocinia（基因型Ⅸ）也属于B.cepacia complex[41]。因此，已报道的洋葱伯克霍尔德菌复合型由9个不同基因型组成，分别是B.cepacia（基因型Ⅰ）、B.multivorans（基因型Ⅱ）、B.cenocepacia（基因型Ⅲ）、B.stabilis（基因型Ⅳ）、B.vietnamiensis（基因型Ⅴ）、B.dolosa（基因型Ⅵ）、B.ambifaria（基因型Ⅶ）、B.anthina（基因型Ⅷ）、B.pyrrocinia（基因型Ⅸ）。后来，Yabuuchi E等人在泰国某地的表层土中分离得到的B.thailandensis的一株，被重新归类为Burkholderia ubonensis，经过鉴定初步断定也归类为B.cepacia complex[42]。各基因型间DNA-DNA同源性为30%～50%，其16S rRNA 和recA 基因序列相似性很高，分别为98%～99%和94%～95%[43]。直到目前，对Bcc的基因型组成仍在研究中，Zhang L等人在玉蜀黍和水稻的根际发现了大量的Bcc菌株，并且通过Bcc recA基因的同源性的分析，发现分离所得的Bcc R456菌株可能属于一种新的基因型[44]。虽然能从不同的环境条件下分离获得大量的Bcc，但却不清楚Bcc株系主要的存活环境。事实上，只有很少的研究涉及环境中Bcc的生态特征，一些研究者也仅仅是对Bcc的一个或几个基因型进行研究[45]。现有的伯克霍尔德菌复合型中有许多有生防效果或是作为植物促生剂，现今生产B.cepacia生物农药的菌株都来源于环境，但问题是，对这些菌株是否是非致病菌也无法区分，因为除了Bcc基因型Ⅵ只能从CF病人中分离到，基因型Ⅸ只从土壤中分离到以外，其他所有基因型的B.cepacia均可从环境和医院中分离[46]。同样，无法很清楚的在菌株基因型或是表现型方面来区分环境菌和人类致病菌。同时，每年都可以从CF的致病菌中获得新的Bcc株系，并且也能够从自然环境中获得这些菌株[47]。因此，如何区分环境菌和人体致病菌以及其是否具有致病性，对应用于农业上的Bcc菌株进行风险评估是必要的，也将是今后的研究难点和热点之一。目前，对细菌的鉴定一般都先选择合适的选择性培养基培养分离出的样本，然后利用生理生化手段检测分离到的菌株，接着利用SDS-PAGE技术，全细胞蛋白电泳，16S rDNA序列分析手段鉴定出分离所得样本的属，最后配合RFLP探针技术或AFLP探针技术以确定菌株的基因型。现有的伯克霍尔德菌复合型由9个不同的基因型构成，各个基因型在形态上非常相近，这就需要非常便利的生物化学的鉴定手段和具有针对性的分子鉴定方法对各个基因型进行精确的区分[48]。利用16S rDNA测序、recA-RFLP分析、recA 基因特异引物PCR检测、DNA-DNA 同源性分析以及全细胞蛋白电泳（PAGE）方法可区分Bcc中的一些种，但还没有一种技术可以针对性的区分出每个基因型。因此，寻找一种简单可行可靠的鉴定技术是今后研究的热点之一[49]。Bcc致病毒力因子包括脂肪酶、蛋白酶、溶血素、脂多糖、过氧化氢酶、内毒素等，以紫花苜蓿作为植物模型研究Bcc的毒力，发现9个基因型中除了B.multivorans 和B.stabilis外，其余都可以从发病的紫花苜蓿上分离获得[50]。但植物与人类病原菌存在着差异，如革兰氏阴性人体条件致病菌绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和植物病原菌丁香假单胞菌（P.syringae）均存在Ⅲ型蛋白分泌系统，但后者对人和动物不致病，表明致病因子存在并不能充分说明其能致病。为了确定细菌致病性毒力的决定因子，Chung J W等人利用蛋白质组学描述来比较两种B.cenocepacia在老鼠肺上的存在状态，发现临床分离所得的C1394 很快被致死，C1394mp2依然存活。利用Two-dimensional（2D）凝胶电泳发现从易感病寄主上得到的C1394mp2，缺少烷基氢过氧化物还原酶亚基C（AhpC）蛋白位点，反之增加了鞭毛蛋白，这使C1394mp2增强了在高温和低pH值条件下的氧化应激能力。这揭示了B.cenocepacia致病毒力在易感模型上出现不同的表现与应激能力的内在原因[51]。对于使用易感动物作为模型进行研究是一个进步，但是对于动物模型的选择、如何利用等都受到时间、道德等原因的制约，寻找合适的动物模型仍是今后需要解决的问题之一。洋葱伯克霍尔德菌对于人本身来讲，是一种可怕的致病菌，不但污染医院的药品和器具，而且引起可怕的“洋葱伯克霍尔德菌综合征”。对于整个人类来讲，有好也有坏。它是自然界中一些植物的病原菌又是一种重要的生防、环保以及工业用菌，减少了对环境的危害，不少国家把它作为生物农药和环保制剂使用。如何区分哪些是人体致病菌、哪些是植物致病菌、哪些是生防或环保菌，成了一个令人困扰的问题。这有赖于对其生态多样性、致病机制以及分类学的全面了解。只有确定Bcc生防或降解菌株对人体不致病，或者该菌株为单独一个种而不是人体致病菌一员时，才能将其安全的应用于农业生产上，使其为人类造福。现在已经有许多研究者从不同的方面入手来进行研究，但仍有未涉及或很少涉及的领域，如该菌在自然界的分布及多样性研究，其基因型的详细鉴定及针对性的鉴定方法，这些都是需要注意的问题。因此，在今后的研究中，要广泛地参考结合各学科领域的研究进展，充分地认识了解该菌的生物学特性及在不同方面的风险性测试评价，以期更好地使其为人类服务。

Previous studies indicate that the plant genus Allium,including bulb onion(A.cepa L.),can be infected by at least seven species of Botrytis at the stages of growth and/or storage(Nielsen et al.,2002).Of these Botrytis species,three,namely B.aclada,B.allii,and B.byssoidea,were reported to be most commonly associated with neck rot of onion(Nielsen et al.,2002).B.aclada was regarded as synonymous with B.allii until 2003,when Yohalem et al.(2003)suggested that both B.aclada and B.allii are valid names.Further analysis showed that B.allii is a hybrid of B.aclada and B.byssoidea(Nielsen and Yohalem,2001)and the hybrid status of B.allii was confirmed in a molecular phylogenetic study conducted by Staats et al.(2005).In China,B.allii was reported to cause brown rot of onion bulbs(Tan et al.,1997),whereas rot of onion bulbs caused by B.aclada has not been documented in this country.In spring of 2006,a kind of rot disease was observed among sold onion bulbs in the supermarket near the campus of Huazhong Agricultural University,Wuhan,China.Surveys of five randomly-selected stacks of onion bulbs in that market indicated that the percentage of diseased bulbs varied from 6 to 50%.Diseased onion bulbs became soft rotten and abundant conidia were produced on the surface of diseased bulb tissues of onion showing a grey powdery appearance.Eight fungal isolates were obtained from 8 diseased bulbs of onion showing the grey mould symptoms.They were individually incubated on potato dextrose agar(PDA)at 20℃ and identified on the basis of cultural and morphological characteristics.Results showed that all of these isolates produced abundant grey-brownish,ovoid-or oblong-shaped conidia,which were budded from terminal ampullae formed on dichotomously-branching conidiophores.The size of conidia for these isolates varied from 7.6 to 10.4 μm in length and from 4.2 to 5.6 μm in width.No sclerotia were produced by these isolates on PDA even after incubation for 30 days.These characteristics of the investigated fungal isolates are similar to those described for B.aclada by Yohalem et al.(2003).One of the eight fungal isolates,OnionBc-15,was used for further identification using molecular methods.Genomic DNA(gDNA)was extracted from mycelia of OnionBc-15 and used as template for amplification of certain DNA regions.The first targeted DNA region is the internal transcribed spacer(ITS)of the ribosomal RNA gene.It was amplified with the universal primer pair ITS1 and ITS4(Nielsen et al.,2002).A 539-bp DNA fragment was generated,cloned and sequenced(GenBank Acc.No.EU093077).The sequence contained two SphI restriction sites and was 99%identical in nucleotides to that of B.aclada strain PRI006(GenBank Acc.No.AJ716295).It is different from B.allii and B.byssoidea,which have only one SphI restriction site for the ITS1/ITS4-amplified DNA sequence(Nielsen et al.,2002).The second targeted DNA region is the L45-550 sequence(Nielsen&Yohalem,2001).It was amplified with the Botrytis-specific primer pair BA2f and BA1r(Nielsen et al.,2002).A 413-bp DNA fragment was generated,cloned and sequenced.Sequencing analysis showed that the 413-bp DNA fragment did not contain any ApoI restriction sites.This is also similar to B.aclada,but different from B.allii and B.byssoidea,which have one ApoI restriction site in the BA2f/BA1r-amplified DNA sequence(Nielsen et al.,2002).Additionally,three house-keeping genes encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(G3PDH),heat-shock protein 60(HSP60)and DNA-dependent RNA polymerase subunit II(RPB2)were amplified from the gDNA of OnionBC-15 with the specific primer pairs reported by Staats et al.(2005).The generated DNA fragments were 886 bp for G3PDH,977 bp for HSP60 and 1093 bp for RPB2,which were cloned and sequenced.They were assigned with GenBank accession numbers as EU100386,EU100387 and EU093078,respectively.Phylogenetic trees were established on the basis of the sequence information of G3PDH,HSP60 or RPB2 cloned from OnionBC-15 in this study and from the 22 species of Botrytis reported by Staats et al.(2005)using the neighbor-joining(NJ)method implemented in the MEGA3.1 package.Each phylogenetic tree was tested with bootstrap(1000 replicates).Results showed that OnionBc-15 was more closely related to B.aclada and B.allii than to other species of Botrytis in each phylogenetic tree.Therefore,it is appropriate to identify the strain OnionBC-15 as B.aclada.This research was funded by the Natural Science Foundation of China(Grant No.30570079).[1]Nielsen K,Yohalem DS.Origin of a polyploid Botrytis pathogen through interspecific hybridization between Botrytis aclada and B.byssoidea.Mycologia,2001,93:264~271.[2]Nielsen K,Yohalem DS,Jensen DF.PCR detection and RFLP differentiation of Botrytis species associated with neck rot of onion.Plant Disease,2002,86:682~686.[3]Staats M,van Baarlen P,van Kan JAL.Molecular phylogeny of the plant pathogenic genus Botrytis and the evolution of host specificity.Molecular Biology and Evolution,2005,22:333~346.[4]Tan WZ,Wang XY,Zhang LX.Two newly recorded fungal diseases of Allium in Yunnan province,China.J.Southwest Agri.Univ.,1997,19:165~167.[5]Yohalem DS,Nielsen K,Nicolaisen M.Taxonomic and nomenclatural clarification of the onion neck rotting Botrytis species.Mycotaxon,2003,85:175~182.

近些年，由于多种原因的影响，小麦黑胚病发生日趋严重，已经成为生产上的重要问题。由于该病危害，导致小麦籽粒质量和等级下降，影响种子出苗和幼苗生长，已成为小麦生产亟待解决的问题之一[1～5]。一些研究报道，黑胚病的主要病原菌链格孢（Alternaria alternata）可以产生致病毒素，甚至能够引起食道癌变，对人类健康有很大的威胁[6]。虽然一些学者对小麦黑胚病的发病规律、品种抗性、防治技术以及黑胚籽粒对小麦出苗和生长的影响做了不少研究工作，但关于黑胚病菌链格孢的致病机制尚不清楚，对该病原菌的致病毒素未见报道[7～9]。对于毒素的致病机理，一些研究认为，是毒素造成了寄主植物某些生理生化方面的异常从而引起了病害症状[10～17]。本研究的目的是弄清小麦黑胚病优势病原菌链格孢所产毒素的生物活性和基本性质，了解病菌的致病机理，为进一步研究工作奠定基础。1.1.1 供试小麦品种 抗病品种：豫麦47、豫优1号、科优1号；感病品种：豫麦18、豫农9901、漯麦4号；种子由国家小麦工程技术中心和河南省农业科学院小麦所提供。1.1.2 供试菌株 小麦黑胚病菌链格孢（Alternaria alternata），由本实验室分离鉴定和保存。1.2.1 粗毒素的制备 转接黑胚病菌菌种于PDA 培养基上培养7d，然后取直径为6.5mm 大小的菌丝块，接种到150ml pH4的PSK液体培养基中（250ml三角瓶），每瓶一块，在25℃、110r/min恒温摇床上培养10～15天，至菌丝变黑。将培养液用滤纸过滤，滤液经高速离心，取上清液用0.45μm 微孔薄膜过滤，得无菌滤液。采用种子萌发和根长抑制法进行毒素生物活性测定。1.2.2 生物学活性测定1.2.2.1 病菌毒素对种子萌发的作用 选取饱满的小麦种子，用0.1%HgCl2进行表面消毒3min，然后用无菌水冲洗干净并用灭菌的滤纸将种子表面的水吸干。取直径9cm的培养皿，放入一张灭菌的滤纸，用5ml无菌滤液、1/4的稀释液、1/2的稀释液和2倍浓缩液的无菌滤液分别浸泡小麦种子，放置在（25±1）℃的培养箱中，3天后记载种子萌发率，以根长超过种子直径者计为萌发，计算种子萌发率和抑制率。抑制率（%）=（清水对照种子萌发率—处理种子萌发率）/清水对照种子萌发率×1001.2.2.2 病菌毒素对种子根生长的作用 选取饱满的小麦种子，加水浸泡12～24h时，倒掉水并用无菌水冲洗3遍后再放到25～26℃恒温条件下催芽。待主根长约2mm时，将种子胚向下摆在事先已铺有毒素浸湿的纱布（或滤纸）的培养皿内，再在种子上覆盖二层同样处理的滤纸，置25～26℃黑暗下培养48h，测定主根长度，并计算抑制百分率。1.2.2.3 病菌毒素滤液对小麦籽粒黑胚率和千粒重的影响 制备病菌孢子悬浮液（10×10倍显微镜下，20～30个孢子/视野）和粗毒素滤液，在扬花后5天、10天和15天分别喷洒到扬花前已套袋的小麦穗上，并在接种后再次套袋。选取3个感病品种和3个抗病品种，每品种每次接种20穗。收获后调查籽粒黑胚率及千粒重。1.2.3 病菌毒素的理化性质测定1.2.3.1 毒素粗提物中蛋白与非蛋白部分的活性测定 在培养滤液中加入2倍体积的甲醇，随后将该培养滤液于10℃下3000r/min离心20min，得到含蛋白质的沉淀（即蛋白部分）和不含蛋白质的上清液（即非蛋白部分）。用蒸馏水将蛋白部分稀释至原培养液体积，非蛋白部分用旋转蒸发仪于60℃下减压蒸发充分除去甲醇后，也用蒸馏水稀释至原培养液体积，分别检测其生物活性，每处理3次重复，以未经处理的培养滤液和清水为对照。1.2.3.2 毒素的酸碱稳定性测定 将毒素培养滤液的pH值用1mol/L NaOH和HCl分别调至3、4、5、6、7、8、9、10。于常温下放置24h后，再调回原值，在60℃水浴中浓缩至原体积，进行活性检测。每处理2次重复，以未经处理的培养滤液和清水为对照。1.2.3.3 毒素的热稳定性测定 将无菌滤液分别于60、80和100℃水浴中处理20min、30min、40min、50min和60min，或于121℃高压灭菌处理20min，用无菌蒸馏水补足损失水分后，检测其生物活性。每处理2次重复，以未经处理的无菌滤液和清水为对照。1.2.4 毒素提取物对小麦种子几种酶活性的影响 选取饱满的小麦种子，表面消毒后置于培养皿中，用浓缩2倍后的无菌滤液处理种子，分别在处理前，处理后3h、6h、12h、24h、36h和48h取样进行酶活测定。1.2.4.1 多酚氧化酶（PPO）提取与活性测定 称取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。加入2ml 0.02mol/L的磷酸缓冲液（pH6.8），于4℃下4000r/min离心15min，上清液即为PPO粗提液。取粗提液100μl，加入pH6.8磷酸缓冲液1.5ml，混匀后于30℃水浴中保温10min。然后加入0.02mol/L邻苯二酚1.5ml，立即计时，于分光光度计398nm下测其3min内OD变化值，以每分钟增加0.01个OD值定义为一个酶活性单位（U），对照为3ml的磷酸缓冲溶液。各样品均重复测定3次。1.2.4.2 过氧化物酶（POD）提取与活性测定 取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。加入2ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH6.0），于4℃下4000r/min离心15min，上清液即为POD粗提液。采用愈创木酚法，在470nm波长下测定吸光值，然后以每分钟每克鲜重OD值变化1.0所需的酶量为一个酶活单位（U），对照为3ml的磷酸缓冲液。各样品均重复测定3次。1.2.4.3 SOD酶活性测定 取材料0.2g，冰浴研磨成匀浆。取4ml的SOD反应液与小烧杯中，加入50μl酶提取液，在加200μl核黄素，混匀（以pH7.8磷酸缓冲液代替酶液作为对照）。在光下反应10min，黑暗终止反应，与560nm下测吸光值。测定结果表明，病菌培养滤液对种子萌发和小麦根系的生长都有明显的抑制作用。培养滤液原液种子根伸长抑制率高达90.18%，对种子萌发抑制率也达到65.0%。浓缩两倍的培养滤液对种子萌发抑制率高达100%，种子根生长抑制率达到99.27%。随着培养滤液浓度的降低，对种子萌发和根系生长抑制率也逐渐下降（表1）。培养滤液浓度平均种子萌发率（%）平均种子萌发抑制率（%）平均根长（cm）平均根长抑制率（%）培养滤液2倍浓缩液0e100.000.02c99.27培养滤液原液35.00d65.000.27c90.18培养滤液1/2稀释液70.00c30.001.18b57.09培养滤液1/4稀释液87.50b12.502.74a0.27清水对照100.00a—2.75a—表1 链格孢毒素培养滤液对小麦种子萌发和根系生长的影响利用病菌孢子悬浮液和病菌毒素滤液分别接种处理小麦穗部，在收获后统计籽粒黑胚率，结果发现病菌孢子悬浮液和病菌毒素滤液处理籽粒黑胚率均比清水对照显著提高，其中病菌孢子悬浮液接种黑胚率高于毒素滤液处理，且扬花后5天和10天接种病原菌发病较厉害。（表2）。处理处理时间（天）感病品种抗病品种漯麦4号豫农9901豫麦18豫麦47豫优1号科优1号CK（套袋）—2.41f3.77e2.35e2.87f0.78e0.79e毒素滤液扬花后5天3.00e6.28d4.24d6.78e2.13c0.95e扬花后10天4.81c15.61c8.53b10.44c2.71b1.51c扬花后15天3.85d6.63d2.82e9.57cd1.60d1.19d孢子悬浮液扬花后5天10.00a19.71a13.61a16.40b2.76b3.03a扬花后10天3.93d15.33c5.86c8.72d2.88b1.54bc扬花后15天6.69b18.28b7.80b18.42a4.36a1.76b表2 链格孢毒素滤液和孢子悬浮液处理后小麦籽粒黑胚率 （%）利用病原菌孢子悬浮液和毒素培养滤液分别处理6个小麦品种的麦穗，发现有些品种籽粒千粒重明显下降，损失率最高达到32.27%，与清水对照差异十分显著。而且，用毒素处理的小麦籽粒千粒重的影响还要大于接种病原菌孢子悬浮液的影响（表3）。处理处理时间（天）感病品种抗病品种漯麦4号豫农9901豫麦18豫麦47豫优1号科优1号CK（套袋）—48.17a47.85a48.28a48.03a47.57a42.32a毒素滤液扬花后5天46.70b36.65d42.83c32.53e41.33c35.37cd扬花后10天36.53c41.20b42.53c34.23d39.39d36.75c扬花后15天46.39b38.58cd40.55d35.01d33.72e33.83e孢子悬浮液扬花后5天46.79b40.11bc44.74b42.98c43.22b35.37cd扬花后10天47.11ab42.76b42.98c45.50b38.28d40.03b扬花后15天46.40b40.39bc41.39cd45.26b33.73e34.33e表3 链格孢毒素滤液和孢子悬浮液处理后千粒重2.4.1 病菌培养滤液中蛋白与非蛋白部分的活性测定 由实验结果可以看出，培养滤液中蛋白等大分子物质部分对种子萌发没有抑制作用说明该部分无致病活性，而非蛋白部分队种子萌发抑制率则与培养滤液原液相似，说明其保留了病原菌培养滤液的致病活性（表4）。处理滤液蛋白部分滤液非蛋白部分培养滤液原液清水对照平均种子萌发率（%）98.3a47.33b46.67b100.00a平均种子萌发抑制率（%）1.7052.6753.330表4 小麦黑胚链格孢代谢物中蛋白部分和非蛋白部分的活性2.4.2 毒素的酸碱稳定性 测定结果表明，用不同pH值处理链格孢培养滤液24h后，其生物活性几乎不受影响，对种子萌发的抑制率都达到50%以上，与培养滤液原液没有明显差异，说明小麦黑胚病链格孢毒素具有较强的酸碱稳定性（表5）。滤液pH值345678910原液清水对照平均种子萌发率（%）46.67b50.00b48.33b45.00b45.00b48.33b45.00b46.67b46.67b100.00a平均种子萌发抑制率（%）53.3350.0051.6755.0055.0051.6755.0053.3353.33—表5 不同pH处理后链格孢培养滤液对种子萌发的活性2.4.3 毒素的热稳定性 由表6可以看出，小麦黑胚病菌培养滤液于60、80和100℃水浴中处理20min、30min、40min、50min和60min处理后活性与没有处理的对照几乎没有差异，而且在121℃下处理20min仍不失活，说明其热稳定性较强。温度处理（℃）处理时间（min）203040506012158.33a———10050.00a51.67a51.67a51.67a51.67a8051.67a55.00a53.33a53.33a51.67a6050.00a53.33a51.67a50.00a51.67a常温55.00a50.00a51.67a50.00a51.67a表6 不同温度处理后链格孢培养滤液对种子萌发的抑制率 （%）链格孢毒素对小麦种子多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的影响见表7。测定结果表明，随着时间的延长，不论是感病品种还是抗病品种在毒素滤液处理后PPO、POD和SOD的活性均下降，且抗病品种较感病品种下降慢。从3种酶活性测定结果来看，SOD活性在毒素滤液处理后下降更为明显。时间（h）PPOPODSOD豫优1号豫农9901豫优1号豫农9901豫优1号豫农9901028.0031.8323.5022.17214.04181.61328.8326.1722.0020.67204.10143.82623.0024.0018.8319.33198.70136.381222.0022.8317.6718.67179.67124.482420.1719.3317.3317.67154.9894.263619.0017.6718.0016.33115.4589.734817.1716.5017.0016.83112.1192.06表7 毒素滤液处理对小麦种子酶活性的影响 （单位：U/min·g）初步研究结果表明，小麦黑胚病菌可以产生致病毒素，该毒素能够抑制小麦种子萌发和根的伸长，并能加重黑胚病的发生，而且能够降低籽粒千粒重，初步结果表明病菌的致病作用与其产生的毒素有关，但是其机制有待进一步研究。对毒素基本性质的研究是进行纯化的基础。虽然本实验研究的毒素是未经提存的粗毒素，但是能够揭示其一般的特性。本实验结果表明，小麦黑胚病链格孢毒素为非蛋白类物质，而且是一种热稳定性及酸碱稳定性均较高的物质。这为以后研究和利用毒素提供了理论依据。SOD、POD、PPO这三种酶是存在于膜系统中的一种抵御活性氧伤害的保护酶，寄主在与病原菌或毒素的相互识别斗争过程中，会产生高出正常水平的活性氧，干扰正常的代谢功能，在正常情况下，活性氧都保持在一个动态平衡状态[11～12]。毒素处理小麦种子之后PPO、POD、SOD的活性均降低，可能由于毒素造成了活性氧清除系统中这三种酶系统的破坏，活性氧过量积累，细胞受到伤害，从而也抑制了种子的萌发。小麦黑胚病菌链格孢毒素的致病作用可能是一个比较复杂的过程，除了本实验研究的几种酶的作用外，还需对其他一些相关酶、细胞膜透性、酚类代谢、氧化磷酸化、细胞器结构等很多理化机制和细胞学结构变化等进行深入研究。同时，也要加强对毒素纯化和结构分析等方面的工作，为进一步研究毒素的性质和作用机理奠定基础。