Cavalier-Smith（1981；1988）提出将细胞生物分为八界，《真菌词典》第八版（1995）和第九版（2001）均接受了这一分类系统。在这一分界系统中，卵菌门（Oomycota）属于色菌界（Chromista），有1纲9目及其他地位待定的4目，其中引起植物病害的有水霉目（Saprolegniales）、腐霉目（Pythiales）、指梗霉目（Sclerosporales）和霜霉目（Peronosporales）[1]。卵菌门的共同特征是游动孢子具有一根茸鞭和一根尾鞭，鞭毛呈直管状，有性生殖为卵配生殖，线粒体呈脊管状。在许多方面卵菌与真菌有明显差异，而与藻类更为相似，因此又称卵菌为假真菌（pseudofungi）。卵菌中有许多是重要的植物病原菌，它们的世代短，产孢量大，潜育期短，再侵染次数多，对寄主植物的破坏性强，流行速度快，造成严重的经济损失[2]。在对卵菌的综合防治的措施中，化学防治仍然是控制卵菌病害的主要手段之一，但目前生产中普遍发生了卵菌对现有杀菌剂的抗药性问题，这对当前农业的发展构成了严重的威胁[3]。随着显微技术、化学分析技术和分子生物学的发展，已经能从病原真菌的形态、生理生化和分子等不同水平进行杀菌剂作用机理和抗药性机理的研究[4]。本文就目前常用的四类内吸性杀菌剂对卵菌的作用机理及抗性机理进行了概述，希望能对杀菌剂的合理使用和新型杀菌剂的开发提供一定的理论基础。病害名称病原物病害名称病原物十字花科白锈病白锈菌（Albugocandida）马铃薯晚疫病致病疫霉菌（Phytophthorainfes-tans）谷子白发病禾指梗霉菌（Sclerosporagra-minicola）瓜类疫病掘氏疫霉菌（P.drechsleri）烟草猝倒病瓜果腐霉菌（Pythiumaphanider-matum）辣椒疫病辣椒疫霉菌（P.capsici）黄瓜霜霉病古巴假霜霉菌（Pseudoperonospo-racubensis）柑橘褐腐柑橘褐腐疫霉菌（P.citrophthora）葡萄霜霉病葡萄生轴霜霉菌（Plasmoparaviticola）表1 我国卵菌引起的主要植物病害苯基酰胺类杀菌剂的特点是低毒，选择性强，可以被植物的根、叶和幼茎迅速吸收，并通过导管和细胞间隙等质外体系统向植株上部转移[5]。目前我国使用量较大的有甲霜灵（瑞毒霉）、恶霜灵和湖南省化工研究院开发的苯霜灵等。Dr.P.A.Urech在1977年研究开发了甲霜灵，它是苯基酰胺类杀菌剂中第一个商品化的品种，其特点是病菌在植物体内形成吸胞后抑菌作用才能发挥，对卵菌侵入寄主前的各阶段，如游动孢子的释放、萌发和侵入的抑制作用不明显，但对侵入寄主后的各阶段，如菌丝在植物体内的生长、吸器形成及孢子囊的产生等有显著的抑制作用[6]。最初对苯基酰胺类杀菌剂容易引起病原菌抗药性的问题并未引起注意，直到 1981年荷兰的Dekker发现甲霜灵单剂在葡萄上使用仅一个季度就发生田间抗药性之后才给以重视。Davides等[7]、Shattock等[8]先后证实，甲霜灵的杀菌机理是抑制卵菌的核糖体 RNA聚合酶的活性，从而抑制病菌 RNA 的合成，干扰病菌在寄主体内的发展。特别是 γ-RNA的合成，最敏感的是使尿苷掺入 RNA受阻，但不影响尿苷的吸收和尿苷转化为尿苷酸。用不同种的菌试验结果说明，RNA合成受阻的程度不同，通常达 40%～80%，这表明不是全部的 RNA合成受阻。现已知道有3种RNA的聚合物担负着细胞内核苷酸的聚合。这3种聚合酶称为聚合酶A、B、C，A主要是负责核糖体内γ-RNA的合成，B是用于m-RNA的合成，C则用于 t-RNA和5SRNA 的合成。这3种酶一般是用对α-鹅膏碱的敏感性来区分的。甲霜灵和其相似物对3种酶有选择性抑制作用，主要是对聚合酶A的毒力最大，也就是γ-RNA的合成受阻，核糖体就不正常。因此，对菌的生长有抑制作用，但是对菌的孢子囊的直接和间接萌发以及游动孢子的萌发都没有影响[9～11]。通过对抗药和敏感菌株杂交后代的分析，表明抗药性是由隐性的单基因或核内的单作用位点控制，发展速度快，抗性水平高，抗药菌株遗传稳定，适合度、致病力几乎与野生的敏感菌相同，故经过施药的选择敏感菌很快消亡，抗性菌在群体中得以繁殖发展，并很快成为优势种群，出现田间突然药剂失效[12]。研究表明敏感菌系细胞核中有编码敏感 RNA 聚合酶的基因，而抗性菌系则不含这个基因，因而对药物的反应不敏感而表现抗药性。同时苯基酰胺类杀菌剂之间具有正交互抗性，这给该药剂的进一步开发带来了很大的困难[13，14]。丙烯酰胺类杀菌剂中对卵菌病害有很好防治效果的药剂主要有烯酰吗啉和氟吗啉，其作用机理基本上都是抑制菌体内麦角甾醇的生物合成。麦角甾醇是菌体细胞膜的重要组成部分，它与膜脂中的碳氢键相互作用，有保持膜的流动性和稳定膜分子结构的重要作用。如果麦角甾醇生物合成受阻，膜的结构和选择性屏障作用就受到损害，造成细胞内物质的泄漏，最后导致菌体死亡。用丙烯酰胺类杀菌剂处理真菌后往往能使芽管短而膨胀、过度扭曲，菌丝分枝增加。烯酰吗啉在1988年由Shen Group公司研制开发。烯酰吗啉可强烈抑制游动孢子囊的形成、休眠孢子的萌发和菌丝生长，但不影响游动孢子的释放。与菌丝细胞壁合成相比，孢子囊壁的合成对烯酰吗啉更为敏感。Bartnicki[15]认为由于休止孢萌发和芽管伸长这些阶段菌体内有相对较少碳水化合物来调节渗透压和形成细胞壁，所以烯酰吗啉作用后细胞壁容易产生破裂。Kuhn等[16]和Albert等[17]研究表明烯酰吗啉能导致菌丝生长过程中细胞壁畸形和加厚，最终导致菌丝顶端破裂，认为烯酰吗啉明显干扰了病原菌的形态调节因子或抑制细胞壁结构的正确组合，影响细胞壁的合成。烯酰吗啉1992年获得注册登记并投放市场，尽管已经使用多年，但国内外的室内和田间实践均证明，烯酰吗啉在田间表现为低抗药性风险。Dereviagina等[18]对田间采集的110株马铃薯晚疫病菌的测定发现，存在0.3%～0.8%的抗烯酰吗啉突变体，但抗性菌株的适合度低，而且在连续转代培养过程中抗性丧失。Bagirova等[19]在室内通过化学诱变获得了马铃薯晚疫病菌对烯酰吗啉的抗药突变体，但突变频率低，而且突变株的适合度明显下降。王文桥等[20]获得了葡萄霜霉病菌抗烯酰吗啉的突变体，但未获得马铃薯晚疫病菌的抗药突变体。袁善奎等[21]对马铃薯晚疫病菌抗烯酰吗啉突变体的研究结果与以上学者的报道一致，没有获得高抗药性水平的突变体，但突变体的抗性比较稳定。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是以天然抗生素Strobilurin A为先导化合物而开发的新型杀菌剂，自1969年Musikek及其合作者首先报道以来，对此类化合物的研究已成为杀菌剂开发的新热点。这类杀菌剂具有杀菌谱广和杀菌活性高的特性，具有保护、治疗、铲除、渗透作用，对环境和非靶标生物安全[22]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的作用位点独特，不同于以往任何抑制剂作用于呼吸链上的位置。Cyt bc1呼吸抑制剂有两类：一类是位于线粒体内膜内壁Qi位点（CoQ的还原位点）的cyt b高势能血红色素结合的抑制剂，这类抑制剂称为Qi位点抑制剂，简称QiIs，如抗霉素，cyanoimidazole等。另一类与位于线粒体内膜外壁的Qo位点（CoQ的氧化位点）的cyt b低势能血红色素结合的抑制剂，这类抑制剂称为Qo位点抑制剂，简称QoIs，如甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂、咪唑菌酮、唑菌酮等[22，23]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为能量生成抑制剂，其作用机理是通过与真菌细胞色素b上的辅酶Q0氧化中心结合，阻止细胞ATP的合成，影响能量代谢，从而抑制线粒体的呼吸作用。这种作用阻止氢醌（QH2）向Fe-S中心传递电子，而不是直接阻止与氢醌的结合[24～26]。细胞色素b属于细胞色素bc1复合体的一部分，位于真核生物线粒体膜的内侧，一旦某个抑制剂与之键合，它将阻止细胞色素b和c1之间的电子传递，阻止ATP的产生而干扰真菌内的能量循环，从而杀灭病原菌。在甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂开发和应用的早期，人们认为这类杀菌剂的抗性风险是中等水平，但是1998年德国使用苯氧菌酯防治小麦白粉病2年后发现防效明显下降，原因是小麦白粉病菌产生了抗药性，而且抗药性个体的适合度很高。目前认为这类杀菌剂的抗药性风险是高水平[26]。已经报道QoIs的两种类型的抗药性机理[27，28]。第一种是细胞色素b基因上的氨基酸序列发生改变，从而降低了与药剂的亲和力，主要是143位甘氨酸被丙氨酸取代（G143A）（如黄瓜霜霉病菌、小麦白粉病菌、葡萄霜霉病菌等）和129位苯丙氨酸被亮氨酸取代（F129L）（如稻瘟病菌）。由于cyt bc1基因是线粒体编码的，其抗性遗传方式表现为母性遗传。第二种抗性机理涉及电子传递链中旁路氧化酶（Alternative Oxidase，AOX）的活性，通过旁路途径减少甚至消除QoIs对病菌电子传递的抑制作用。（咪）唑类杀菌剂活性高、作用机理独特，与现有杀菌剂无交互抗性，能与多种杀菌剂混配，可有效缓解内吸性杀菌剂的抗性问题。唑菌酮由杜邦公司开发，对锈病、霜霉病、晚疫病等均具有良好保护、治疗、渗透、内吸等作用。它对病原菌在生长过程中所释放出的孢子影响最大，药剂一旦与孢子接触，孢子即停止活动，出现崩死。另外，对孢子的萌发和菌丝的伸长也有一定的抑制作用[30]。唑菌酮能抑制病原菌线粒体的电子传递，主要阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，使病原菌无法产生所必需的能量。417407唑菌酮也是QoIs，作用机理同于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。由于分子结构的差异，它与cyt b的结合方式不同[31]。唑菌酮能抑制病原菌线粒体的电子传递，主要阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，使病原菌无法产生所必需的能量。417407唑菌酮也是QoIs，作用机理同于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。由于分子结构的差异，它与cyt b的结合方式不同[31]。类型代表品种杀菌机理抗药性风险水平苯基酰胺类甲霜灵恶霜灵苯霜灵抑制卵菌的核糖体RNA聚合酶的活性，从而抑制病菌RNA的合成，干扰病菌在寄主体内的发展作用位点单一，容易产生高水平抗药性突变菌株丙烯酰胺类烯酰吗啉氟吗啉抑制菌体内麦角甾醇的生物合成，造成细胞内物质的泄漏，最后导致菌体死亡突变频率低，突变菌株适合度差，表现为低抗药性风险甲氧基丙烯酸酯类嘧菌酯苯氧菌酯烯肟菌酯通过与细胞色素b上的辅酶QO氧化中心结合，阻止细胞ATP的合成，从而抑制线粒体的呼吸作用单一位点的突变，表现为高水平的抗药性（咪）唑类唑菌酮咪唑菌酮阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递通道中ADP-ATP的氧化磷酸化作用，抑制病原菌线粒体的电子传递田间使用较少，抗药性风险水平暂时不明确表2 防治卵菌病害的内吸性杀菌剂的主要类型、代表品种、杀菌机理、抗药性风险水平杀菌剂对病菌的影响是多方面的，其作用位点也相对比较复杂，由于病原菌抗药性的不断出现和抗性程度的不断上升，对研制开发广谱、新型杀菌剂的要求越来越强烈。但化学杀菌剂开发的难度越来越大，开发费用越来越高，开发新型农药的速度远远落后于病原菌抗性发展的速度。因此，明确杀菌剂的作用机理和抗性机理，对创制作用机理独特、环境友好的杀菌剂尤为重要。卵菌的进化一般认为是从水生到陆生，由腐生到专性寄生。卵菌大部分生活在水中或潮湿的土壤中，部分比较高等接近陆生的卵菌主要寄生在高等植物体内。因此，卵菌具有一个共同的特点“亲水—疏油”。因此，在农药剂型的选择上，水剂、水乳剂、水分散粒剂、悬浮剂与卵菌有更好的亲合性，更适合卵菌病害的防治，能更好地发挥药效[32]。在新型农药品种开发的时候，要进行抗性风险评估，采取科学合理的防治措施和使用规范。在未产生抗药性之前推广使用混合制剂，这样能减少选择压力，延缓抗性的产生，延长已开发产品的使用寿命。因此，根据卵菌的生物学特性、卵菌病害循环的规律和药剂的作用机理，要将病害的预测预报、农药剂型、用药规范、作物种类、作物品种、当地的气候条件和当地作物的抗性水平等因素结合起来，综合考虑制定防治策略，才能保证农业的可持续发展和生态环境的和谐发展。

番茄早疫病菌（Alternaria solani）是保护地和露地番茄生产的重要病害之一，为真菌性病害，为害植株后出现慢性枯萎，植株矮小，果实膨大等，可大幅度降低番茄的产量和品质。我国自20世纪80年代开始发生以来，已经成为番茄设施栽培的限制性障碍[1]。在防治上由于长期大量的化学农药使用，使病菌产生了抗药性，防效逐年降低，同时造成了一定的农药污染[2]。随着环境保护呼声的日益高涨，高毒农药的负面影响已引起世界范围的广泛关注，以高效，低毒农药逐步替代传统的高毒农药是农药发展的必然趋势。植物源农药可在环境中迅速分解，对环境无任何影响，是符合环境保护，农业持续发展方向的[3]。细辛（Asarum siebotdii）是多年生草本植物，据中华临床中药学（上卷）记载，根能入药，具有祛风，散寒，风湿弊痛，抗炎等功效，在中药学上有广泛的用途[4]。本实验用中药细辛的根提取物对番茄早疫病菌的菌丝生长及分生孢子萌发的抑制作用进行了室内活性测定，旨在为开发出一种经济、安全、有效的新型杀菌剂提供理论依据。1.1.1 供试样品 试验所用细辛采自山西省历山自然保护区，将采集的植物材料洗净后在室内阴干（约25℃），放入恒温箱内（40～45℃）烘干，磨碎，过60目筛，备用。1.1.2 供试菌种 番茄早疫菌（Alternaria solani），由山西农业大学农学院植物病理实验室提供。1.2.1 细辛提取物的制备 准确取3份细辛根粉50g，分别装入500ml小烧杯内，加入干粉5倍量的有机溶剂甲醇、氯仿、石油醚。室温下（30±2）℃浸泡3～5天后，过滤并浓缩至稠膏状，称取一定量的提取物，加2～3滴吐温80做乳化剂，并依次配成实验所需的浓度，4℃下保存。1.2.2 细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用 采用生长速率法[5]，用打孔器取6mm菌落边缘生长旺盛的菌种，放在加药的PDA平板上培养，以培养基内加等量无菌水作对照，每次重复3次，置25℃下培养。用十字交叉法测每个菌落的直径，以其平均值代表菌落的直径，以下式求出抑制菌丝生长率：抑制菌丝生长率%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.6）×100%1.2.3 细辛提取物对孢子萌发的抑制作用 分别将3种有机溶剂的细辛提取物制成最终浓度为1mg/ml的细辛提取液的PDA培养基。待培养基冷却后，取预先配置好的孢子悬浮液10μl，接种到直径为9cm的培养皿中央，用涂布器涂抹均匀，在25℃培养箱中培养48h，观查记录孢子萌发数量。每处理设5个重复，取平均值。计算孢子萌发率和抑制率。孢子萌发率（%）=已萌发孢子数/镜检孢子总数×100%抑制率（%）=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100%1.2.4 细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝抑制中浓度（MIC）的测试 将细辛氯仿提取物稀释成5个浓度（4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml），测试不同浓度的提取物对番茄早疫病的病原菌菌丝生长的抑制作用，计算毒力回归方程及抑制中浓度（MIC）。细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用实验结果如表1。在48h时，石油醚提取物的抑菌率为28%，氯仿提取物的抑菌率为66.67%，而甲醇提取物的抑菌率达到了50%。并且随着时间的推移，3种溶剂提取物的抑菌率都有所下降。同时与对照相比，处理的菌丝在培养皿中出现气生菌丝减少，变粗，向上生长现象。这一结果说明，3种不同溶剂的细辛提取物在浓度为2mg/ml时对番茄早疫病的病原菌均有不同程度的抑制作用。溶剂menstruum菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate甲醇methanol1.8550.002.9051.584.5748.82氯仿chloroform1.4366.672.5060.002.7359.57石油醚Petroleumether2.428.004.2024.216.918.71CK3.10—5.35—8.35—表1 细辛提取物对番茄早疫病菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的影响见表2。48h后，石油醚和氯仿提取物表现出了显著的抑制率，对分生孢子萌发抑制率分别为91.48%和88.79%，甲醇提取物表现出了较强的抑菌率，达到53.81%。实验过程中发现，对照皿在接种后32～48h即开始陆续萌发，而提取物各处理均不同程度地表现出萌发推迟的现象。溶剂menstruum孢子萌发率（%）Rateofgerminationofconidia萌发抑制率（%）Percentageofinhibition甲醇methanol42.8253.81氯仿chloroform10.4288.79石油醚Petroleumether7.9291.48CK92.92—表2 细辛提取物对番茄早疫病菌孢子萌发的抑制作用Table 2 Inhabiting effect of the different menstruum of Asarum siebotdii extract against conidiao production of Alternaria solani由表1可见，3种不同溶剂的提取物中氯仿提取物的抑菌效果最好，为了进一步确定其生物活性，求出MIC，将细辛氯仿提取物稀释成5个不同浓度，对病原菌进行测定。结果见表3、表4，6天后，浓度在4mg/ml时，氯仿提取物表现出了显著的抑菌率，达到77.14%，而浓度为0.25mg/ml时，抑菌率显著下降，只有9.5%。这一结果说明，细辛氯仿提取物对番茄早疫病菌菌丝的抑制作用与浓度成正相关，随着浓度的下降，抑菌效果也随之下降。同时在96h时求得毒力方程和氯仿提取物的抑制中浓度（MIC）为1.57mg/ml。病原菌Pathogen浓度（mg/ml）concentration菌落直径（mm）与抑制率（%）ColonyRadiusandInhabitingrate48h抑制率Inhabitingrate96h抑制率Inhabitingrate144h抑制率Inhabitingrate番茄早疫病菌Botrytiscinerea4.00001001.9573.622.2577.142.0001.2364.682.9354.404.1251.271.0001.6243.303.4344.634.7342.730.5001.8530.304.2329.045.7229.130.2502.0419.505.307.507.139.50CK2.39—5.72—7.82—表3 不同浓度的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of the different concentration of Asarum siebotdii extract against mycelia Growth of Alternaria solani处理Treatment毒力方程?RegressiveequationMIC??相关系数r番茄早疫病菌AlternariasolaniY=2.0910+1.6950x1.570.9707表4 细辛提取物对番茄早疫病的毒力Table 4 Virulence of the extracts of Asarum siebotdii seeds against Alternaria solani植物源农药活性物质主要来源于植物体内产生的次生代谢产物，据Swain于1977年报道，次生代谢产物已超过400000种，如有机酸、萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、蛋白质、单宁和多糖等[6]。据文献报道，苦参中含有苦参碱（Matrine）和氧化苦参碱（Oxymat-rine）等17种化学结构相似生物碱，其中以苦参碱为其最主要的活性成分，对病原菌有较强抑制作用[7]。另外，毛蒿植物中的毛蒿素，南欧丹参中的硬尾醇，苜蓿根部的苜蓿酸以及海红豆中的紫檀素，黄连体内的小孽碱等均具有很强的抗真菌作用[8]。本实验研究表明，3种溶剂的细辛提取物对番茄早疫病菌菌丝和分生孢子萌发都有不同程度的抑制作用，但它们之间的抑制作用存在差异，在抑制菌丝生长方面，氯仿提取物效果最好，甲醇提取物次之，石油醚提取物效果最差。在抑制分生孢子萌发方面，石油醚提取物效果最好，氯仿提取物次之，甲醇提取物效果较差。由于3种溶剂的极性不同，从以上实验结果初步推断细辛体内抑制番茄早疫病菌的活性物质不止一种，而且极性大小在石油醚和氯仿之间。今后的研究方向是探索分离细辛提取物中的活性成分，为进一步产品开发奠定基础。至于细辛提取物是否对其他病菌有抑制作用，有待在以后的实验中证明。

在自然界，植物、微生物和环境之间的关系是极其复杂的。只有详细了解生防微生物在植物根际或叶围与病原物及其他生物、植物及其分泌物、土壤及各种环境因子之间的相互作用及其变化规律，才能有效地调控无机、有机环境，更好地发挥生防微生物的防病功能[1]。国内外在探索环境因素在植物与微生物互作过程中的影响方面，已经开展了较多工作，包括温度、湿度、降雨、光照等气候条件，土壤理化性质，作物栽培条件等。在纳米技术出现之前，人们很难认识到自然环境中的纳米颗粒物对微生物的影响。近年来，大气等环境中纳米颗粒（超细颗粒物）的生物效应已开始深入研究[2，3]，如光催化纳米二氧化钛对很多微生物都具有杀菌作用[4，5]。这样对于暴露在自然条件下的细菌尤其是叶围微生物，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的一个重要考验。蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus 905菌株是本实验室从植物上分离获得的生防细菌，具有促进植物生长，增强农产品品质和防治多种植物病害的功效[6]，并已开发应用于农业生产，取得了预期的经济、生态及社会效益。前期研究发现，离体条件下该菌株在纳米颗粒光催化作用的影响下存活率明显降低。二氧化钛表面产生的·OH和其他如H2O2、O·2等活性氧都参与了灭菌作用[7]。鉴于光催化纳米二氧化钛具有广谱的杀菌作用，我们必须考虑到它对于自然界中有益微生物的影响。本研究以已在生产中应用的有益芽孢杆菌（Bacillus cereus 905）为研究对象，分析纳米TiO2作用下，该细菌在黄瓜叶围存活能力的变化，有助于阐明纳米颗粒对植物叶围微生物的影响。分别称取适量的纳米TiO2（P25，Degussa Co.），高压灭菌，保存于暗处。使用前加入无菌磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH 7.0），超声波水浴振荡30min使纳米TiO2均一地分散于溶液中。Bacillus cereus 905（GFP），由中国农业大学植病系生防室分离保存并用GFP标记[8]。将B.cereus 905（GFP）接种至含有相应抗生素的LB培养基，30℃160 r/min悬浮振荡培养过夜，1000×g离心收集菌体，用无菌磷酸缓冲液洗涤菌体两次，收获的菌体重新悬浮于磷酸缓冲液中，菌体浓度由平板活菌计数法来确定。所有试验选择在日光温室生长的，4片真叶龄的健康黄瓜植株（Cucumis sativus cv.CAU NO.32）上进行。用B.cereus 905（GFP）菌悬液（108CFU/mL）喷雾接种叶面，或直接将叶面浸润菌悬液3s钟接种。这样的接种程序可以达到107CFU/叶的接种量。接种1h后用美术喷笔（Airbrush，HD-470，台湾）将TiO2悬浮液（0.2mg/mL）均匀喷雾在接种过的叶面上。使用美术喷笔是为了使TiO2以极小的雾粒（平均体积750μm3）覆盖叶围，既不蘸湿叶面也避免了叶围微生物的空间移动[9]。处理后的植株继续在日光温室内培养一定时间后，取样进行原位观察或平板回收。每个处理，随机取5片叶子，每片叶子随机切割6个1cm×1 cm的组织用以原位观察，用激光共聚焦扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，Nikon EZ-C1）迅速扫描叶的上表面，寻找发绿色荧光细菌，操作要求熟练，防止荧光淬灭。每个取样点，每个处理随机取5片叶子，每片叶子置于预装30mL无菌缓冲液（0.1mol/L磷酸缓冲液，0.1%Bacto-Peptone，pH 7.0）的离心管或灭菌袋中，超声波水浴振荡7min，充分洗脱叶围微生物[10]。叶围洗脱液梯度稀释后，涂布至含有相应抗生素的LB平板上，30℃培养1～2天，通过菌落计数估计B.cereus 905的群体数量。对于纳米二氧化钛光催化杀菌作用机制的研究表明，二氧化钛吸收波长≤387.5nm近紫外光的光能，产生·OH，以及H2O2、O2等活性氧，从而起到杀灭B.cereus 905的作用，纳米二氧化钛本身对于B.cereus 905没有暗毒性[7]，则实验中同时设一个低水平的光照条件作为参比。由于是利用太阳光作为光源，能穿透玻璃到达植物叶面并被纳米二氧化钛所吸收利用的光波绝大多数为UVA（320～400nm），在日光温室的一角通过设遮阳网来创造低UVA剂量的光照条件。纳米二氧化钛处理后的植株继续在日光温室内培养8h，立即取样进行原位观察或平板回收。8h内低UVA剂量的光照条件和正常日照条件下的平均UVA辐射强度分别为0.2mw/cm2和1.3mw/cm2。图1 纳米二氧化钛对B.cereus 905（GFP）在黄瓜叶围存活能力的影响Figure 1 The impact of nano-TiO2 to the survival of B. cereus 905 on the cucumber phyllosphere如图1所示，两种不同UVA剂量光照8h后，在纳米二氧化钛的影响下，B.cereus 905的残余量分别降低为对照（纳米二氧化钛浓度为零）的52.4%（0.2mw/cm2）和11.6%（1.3mw/cm2）。对照处理B.cereus 905的存活能力保持在106CFU/叶的水平，甚至在低UVA剂量的光照条件下，纳米二氧化钛处理的B.cereus 905的存活能力也能维持与对照同一数量级的水平；而在高UVA剂量的光照条件下，B.cereus 905的存活能力明显下降，甚至发生数量级的变化，群体数量比对照下降了88.4%。原位观察结果也与平板回收的结果保持一致（见图2）。对每个叶片随机切取组织块扫描观察发现，在所有的处理中不论是单个细菌还是细菌聚集体，它们在叶围的存在位置与叶表面的结构特征有关。叶表面对于细菌来说是一个非常不平坦的生活环境。它实际上是掩藏有许多不同结构的区域的集合体，包括腺毛、钩毛、气孔、表皮细胞和纹理等。大多数观察到的细菌位于叶的纹理或腺毛处，也有一部分位于表皮细胞上或气孔附近。在纳米二氧化钛处理的叶面，观察到的细菌数量较少，并且很难观察到单个细菌，大多数细菌以聚集体的形式存在。Monier J-M和 Lindow SE也发现菜豆叶面菌Pseudomonas syringae以单个细胞的存在形式比以聚集体的形式对于环境的干燥胁迫更为敏感[11]。图2 Bacillus cereus 905（GFP）在黄瓜叶围存活情况（原位观察）Figure 2 The survival of Bacillus cereus 905 on the cucumber phyllosphere（Microscopy of Bacteria in Situ）本研究表明，在正常日照情况下，B.cereus 905的存活能力明显下降，群体数量比对照下降了88.4%。无论是原位观察还是传统的平板回收结果说明，受二氧化钛光催化杀菌作用的影响，有益微生物B.cereus 905在黄瓜叶围的存活能力明显降低，这与在离体条件下得到的结论[7]相一致。鉴于光催化纳米二氧化钛广谱的杀菌作用，我们必须考虑到它对于自然界中有益微生物的影响。对纳米颗粒物生物效应的研究，是一个急需研究的领域。空气及植物表面等许多地方都存在许多纳米级颗粒，对于暴露在自然条件下的细菌，适应这种较为苛刻的环境将是细菌生存的一个重要考验。尤其是随着纳米包膜肥料、纳米土壤改良剂、二氧化钛光合作用促进剂等的产业化，以及农业生产中的投入使用，会使越来越多的人们注意到这一问题。目前对于纳米颗粒作为环境因素对植物、微生物影响的研究并不多见，本文探讨了有益微生物在植物表面受纳米颗粒影响而产生的存活能力问题，但如何创造生防微生物的适宜环境，或改进其对环境的适应能力以提高生防制剂效果的稳定性，还需要进一步深入的研究。

木霉菌（Trichoderma spp.）广泛存在于土壤及其他基物中，作为生防菌以其生长速度快，产孢量大、作用谱广、作用机制多样、能在植株、土壤中增殖并形成有效群体等诸多优势而备受关注。我们针对蔬菜上常见病害，从土壤中分离、筛选获得对蔬菜病原菌具有较强抑菌活性的绿色木霉菌株Tr9701，通过对其产几丁质酶活性等对其抗病机理进行了初探，同时试验了其在黄瓜叶片、根部的定殖能力，为今后开发可替代某些化学农药的微生物杀菌剂做了基础性工作，现将初步研究结果记述如下。1.1.1 供试菌株 绿色木霉Tr9701（Trichderma viride），由天津市植物保护研究所生防室筛选、鉴定。供试病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），由天津市植物保护研究所病害室分离、鉴定。1.2.1 绿色木霉菌制剂几丁质酶检测据Harman等的方法[1]，在胶体几丁质培养基中培养绿色木霉菌，进行产几丁质酶预试验，然后将绿色木霉菌分生孢子液接种到合成诱导液体培养基中诱发几丁质酶产生，以不加胶体几丁质为阳性对照，在28℃，150r/min振荡培养，连续提取培养液制备几丁质酶粗提液。检测采用还原糖法[2]处理，在试管中加入几丁质酶粗提液、10g/L胶态几丁质各1ml，37℃恒温水浴30min，加入DNS10ml，混匀后沸水浴10min，用水冷却至室温，观察颜色变化，以100℃高温灭活处理15min几丁质酶粗提液为对照，试验重复3次。1.2.2 绿色木霉几丁质酶粗提液对病菌的抑菌活性测定 将黄瓜立枯丝核菌、番茄灰葡萄孢霉菌菌丝块转移到平板上，每平皿接种4块，分布于4角，平皿中心放滤纸片并加入100μl几丁质酶粗提液或阳性对照液，重复3次，空白加入等量无菌水，定期观察抑菌圈大小。1.2.3 绿色木霉菌对立枯丝核菌重寄生作用的显微观察 将灭菌赛璐玢膜置于直径90mm的水琼脂培养皿上，在平板两侧各植入经活化培养的绿色木霉和立枯丝核菌菌丝块，25℃下对峙培养，待菌丝接触后置于光学显微镜下观察。1.2.4 绿色木霉菌在黄瓜叶片和根部的定殖 取菜田表层10cm深处土壤，混腐熟的猪粪和蛭石（按3：1：1比例），过筛后，用150倍甲醛液消毒，边喷边混，喷匀后堆起，盖塑料布闷5天，然后晾晒14天，待残药挥发后铺于苗床待用。同时将冰箱保存的绿色木霉菌活化，转接到小麦粉培养基上，在25℃温度下培养7天，培养基上长满菌丝和孢子后，在组织捣碎机中捣碎、过滤，配成绿色木霉菌孢子悬浮液（5×106个孢子/ml）备用。木霉菌叶面定殖：将培养制成的孢子悬浮液用消过毒的手持喷雾器喷雾，均匀喷至黄瓜叶面正反两面，直到叶面上均匀布满一层细微水珠而不流淌为止。喷雾后1h取第一次样，以后每隔一周取一次样，共4次。每次每处理取的叶片剪成0.5cm见方小片，称量取样叶片加入10倍无菌水中振荡（120r/分）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。木霉菌根际定殖：将培养制成的孢子悬浮液，均匀浇灌至黄瓜根部，直至黄瓜苗根部土壤全部浸润为止。浇灌后1h取第一次样（地下1～2cm处根围土壤），以后每隔3天取一次样，共4次。检查时，分别称取根围土壤1g，加入无菌水20ml中振荡（120rpm）15min。取稀释液0.1ml涂布于木霉选择性培养基上，25℃下培养3～4天，5皿重复，计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量，菌量以cfu/g叶表示。通过预试验，绿色木霉菌Tr9701在胶体几丁质培养基上生长可以形成显著几丁质酶解透明圈，因此进行了绿色木霉菌几丁质酶的诱导试验。诱导条件下几丁质酶粗酶液加入DNS后变为深棕红色，与阳性对照相比有显著差异，说明绿色木霉菌菌株产生几丁质酶，且经诱导处理的绿色木霉菌几丁质酶产生量明显提高，经检测，在培养第5d时达到最大值。绿色木霉菌Tr9701几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌活性在平皿接种后2天内，立枯丝核菌、灰葡萄孢霉菌丝生长迅速，但菌丝接近木霉几丁质酶粗提液接种点周围时，生长缓慢，最后停止，从而形成明显抑菌圈。空白对照无抑菌圈，立枯丝核菌菌丝长满平皿，灰葡萄孢霉菌丝长满平皿并形成大量菌核。试验表明，绿色木霉Tr9701的几丁质酶粗提液对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉的抑菌圈直径分别为28mm和15mm，比阳性对照的抑菌圈直径大，其差异达到了显著水平。显微观察显示绿色木霉菌对立枯丝核菌具有较强的寄生能力，绿色木霉菌丝与立枯丝核菌菌丝接触后并列生长或缠绕，有时以钩状结构入侵立枯丝核菌菌丝。在接触后期则观察到被寄生的立枯丝核菌菌丝断裂和消解的现象。2.4.1 绿色木霉菌在黄瓜叶面的定殖 绿色木霉菌在叶面上的定殖动态见表1。由结果可知，绿色木霉菌在叶面环境中由于各种条件的影响，第一周内的菌量比初始菌量降低。此后绿色木霉菌适应了叶面环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为1.02×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.12×104cfu/g叶片。镜检观察绿色木霉菌Tr9701在叶面喷雾后，主要定殖于叶面气孔周围、腺毛基部及叶面凹陷处。这些位点或是分泌物产生处，或是叶面水分分布较多处，能为绿色木霉菌的生长繁殖提供适宜的条件。同时，这些位点也是其他病原菌的竞争位点，通过绿色木霉菌的人工接种，相比病原菌具有种群数量大，出现早的特点。因此，绿色木霉菌对这些位点的抢先占领，不仅有利于本身的生存，而且使黄瓜叶面受到保护，免于病原菌的侵染。重复调查时间1h3天7天14天21天28天11.241.210.941.150.830.1820.960.950.810.920.660.0831.151.080.860.980.790.1441.371.400.951.030.720.10平均1.181.160.891.020.750.12表1 绿色木霉菌孢子在黄瓜叶片上定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）2.4.2 绿色木霉菌在黄瓜根际的定殖 绿色木霉菌在黄瓜根际土壤中定殖结果见表2。由结果可知，第一周内土壤的菌量比初始菌量降低，可能是在根际土壤环境中，由于各种因素的影响，木霉菌受到一定抑制，此后绿色木霉菌适应了土壤环境，菌量逐渐回升，第14天检测菌量为2.64×104cfu/g叶片。21天后菌量持续下降，尤其是第28天菌量降至0.68×104cfu/g叶片。在调查中发现，绿色木霉菌定殖黄瓜根部能力受水分含量和pH值影响明显，水分偏高或偏低都影响绿色木霉菌菌株在黄瓜根部的定殖，pH偏酸性条件下的定殖量明显高于偏碱性条件下的定殖。重复调查时间1h3天7天14天21天28天12.432.371.852.521.090.6422.692.592.032.731.240.7232.362.321.892.611.080.6542.842.561.942.701.110.71平均2.582.461.922.641.130.68表2 绿色木霉菌孢子在黄瓜根部定殖情况（孢子着生量×104个孢子/g）木霉菌腐生性强，适应性广，生长和繁殖快，可迅速利用营养和占据空间，是当前微生物菌剂控制病害的研究热点[3]。本试验结果表明，我们所筛选的绿色木霉菌Tr9701有较强的产几丁质酶活性，且经诱导处理酶产量明显提高，其酶粗提液经试验对立枯丝核菌、灰葡萄孢霉有显著抑制作用，通过诱导产生的木霉几丁质酶在对于抑制病原菌的生长具有重要意义。经显微观察发现，绿色木霉Tr9701对于立枯丝核菌是通过趋向生长、识别、接触缠绕和穿透，寄生于病原真菌之上，对立枯丝核菌具有较强的寄生能力。此现象证明，当绿色木霉菌遇到立枯丝核菌等病原菌时，受到刺激和诱导，产生溶菌酶，抑制立枯丝核菌等的生长，并可降解菌丝。生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本研究表明，绿色木霉菌可以在黄瓜叶面和根部定殖。据Darah（1991）报道，根圈微生物的分布与沿根的可溶性碳的分布距离有关，微生物量的积累有赖于根分泌物的释放，因此添加一定的营养可以促进绿色木霉Tr9701的定殖。本研究进一步证明，绿色木霉Tr9701产几丁质酶、寄生、定殖能力强，是较好的生防材料。当前由于生防微生物控制植物病害具无污染、价格低廉的优点，具有广阔的应用前景。因此对绿色木霉菌Tr9701的发酵工艺、田间应用范围等有待进一步研究。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起的一种在我国乃至全球分布的重要病害。尤其是保护地番茄，其高湿条件为该病流行创造了有利的发病条件。目前番茄生产由于缺少抗病品种，防治番茄灰霉病仍主要依靠化学防治，多采用速克灵等化学药剂喷雾，但在连续使用的情况下，病菌逐渐产生了抗药性，防效逐年下降。此外，大量使用化学药剂也造成了严重的农药残留问题和环境污染问题。近年来人们通过大量筛选和利用抗灰霉病的有益微生物及其代谢产物，使生物防治日益成为番茄灰霉病控制中的一条重要而有效的途径。作者研究了本实验室筛选的拮抗放线菌B1菌株对番茄灰霉病的生防效应，并对其分类地位进行了初步鉴定，为该菌株的应用与开发提供基础。B1菌株是从北京番茄温室土壤中筛选得到的一株拮抗菌，平板抑菌试验结果表明，它对多种植物病原细菌和真菌有较强的抑制作用，其中对灰葡萄孢的抑制能力最强，抑制率达86.3%。B1代谢产物对番茄灰霉菌的菌丝有扭曲、膨大等致畸效应。室内离体检测表明B1菌株对番茄离体叶片和果实的灰霉病均有较好的防治效果。温室试验证实B1菌株对番茄苗期的灰霉病的防治效果在60%以上。根据B1菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，将其鉴定为链霉菌属淡紫灰类群（Streptomyces lavendulae）。

灰霉病是保护地蔬菜栽培中危害十分严重的病害，传统的化学防治造成了严重的农药残留和环境污染。应用微生物进行生物防治能够克服上述缺点，是一种安全、有效和环保的方法。本研究旨在从黄瓜植株内分离、筛选能够抑制灰霉病的拮抗细菌，并测定拮抗菌株在不同处理下对灰霉病的防治作用。主要结果如下：通过平板对峙培养筛选出8株对黄瓜灰霉病菌具有较强拮抗作用的细菌，再对这8株菌发酵滤液的抑菌活性进行测定，选出抑制效果最好的两个菌株B12和B13，抑制率分别为84.0%和81.8%。在离体叶片上，B12、B13发酵滤液对灰霉病菌的扩展均有较强的抑制作用，抑制率分别为83.2%和81.4%。两菌株活性产物可引起病原菌菌丝扭曲，菌丝膨大成串珠状分枝，顶端膨胀后细胞壁破裂，原生质外溢，产生溶菌作用。B12、B13发酵液对于灰霉病菌孢子的萌发具有强烈的抑制作用。在孢子萌发试验中，经B12、B13发酵液处理的孢子萌发率仅分别为5.5%和8.6%，滤液对孢子萌发的抑制效果与发酵液相近。将两菌的发酵滤液置于不同的温度和pH环境下处理，当温度在100℃以下、pH值在6～9时，滤液的抑菌效果表现出较强的稳定性。在温室试验中，两菌发酵液对灰霉病有较好的预防效果，B12、B13的保护防效分别为70.5% 和68.7%，治疗防效分别为51.2%和47.8%。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是土壤和植物微生态的优势种群，内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，对农作物安全。作为植物根际有益微生物，通过分泌抗生物质和生长竞争，在防治植物病害方面发挥多种有益作用[1]。剂型以活体芽孢为主，田间施用可以较长时间的发挥抑制病菌作用[2～3]。枯草芽孢杆菌Xi-55是本课题组从水稻植株上分离、筛选出来的一株活性较强的生防菌株，研究发现对多种植物病原菌具有良好的防治作用[4]。芽孢杆菌的发酵培养是工业化大规模生产芽孢杆菌制剂的前提。本文对所筛选出的枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化，进行20L发酵罐的放大培养研究，以提高其发酵水平，为芽孢杆菌制剂的工业化生产提供参考依据。1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌Xi-55，四川省农业科学院植物保护研究所分离获得。1.1.2 培养基 斜面培养基（LB培养基）：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。种子培养基（BPY培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母膏 5g，葡萄糖 5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。基础发酵培养基（KB培养基）：蛋白胨 20g，甘油 10ml，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。1.2.1 培养方法 将保存在斜面上的菌种用接种环以划线形式接入LB平板上，28℃恒温培养24h活化。将活化的菌株接入装有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，在28℃，180rpm条件下，振荡培养36～48h，制备液体种。按1%的接种量接入发酵培养基（100ml/250ml三角瓶），摇床振荡培养，测定发酵菌数量。1.2.2 生长量的测定 采用平板菌落记数法。培养液用10倍梯度稀释法稀释6～7个梯度（101，102，103，……，107）后，选择3个稀释度较高的梯度稀释液，分别吸取50μl在LB平板上，然后用灭菌的L形玻棒将菌液涂匀，每梯度重复3次。28℃恒温培养24～36h后，调查平板上的菌落数，然后计算活菌数（cfu/ml）[5]。1.2.3 培养基的优化 采用正交表L9（34）[6]，四因素三水平安排试验。1.2.4 发酵条件的优化 采用优化培养基通过单因子试验，测定不同时间、温度、初始pH值、接种量和装液量对发酵菌数的影响。1.2.5 扩大培养 采用德国产Biostat C 20L全自动液体发酵罐，配制发酵培养基10L，添加消泡剂CXX-910 0.5‰。种子培养及接种量均同摇瓶试验。发酵技术参数设为：发酵温度28℃±0.5℃，通气量10L/min，搅拌转速180rpm，溶氧控制设定为以通气量为主、转速为辅，罐压0.05～0.06MPa，初始pH值为7.2。每隔4h取样，测定发酵菌数和观察芽孢形成情况，同时记录罐体内pH值变化。分别以培养时间为横坐标，菌数和pH值为纵坐标，绘制枯草芽孢杆菌在发酵罐中培养的生长曲线和pH值曲线。采用L9（34）正交设计方案，分四因素三水平对Xi-55发酵培养，测定高峰期菌数，正交试验因素水平见表1，正交设计及结果见表2，极差分析见表3。结果表明：4种营养成分对其菌数影响的顺序是A＞C＞D＞B，培养基成分优化组合为A3B2C1D3，即蛋白胨3%，甘油1.0%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.15%。试验因素Experimentalfactor水平（Level）（%）123蛋白胨（Peptone）123甘油（Glycerine）0.51.01.5K2HPO40.050.100.15MgSO4·7H2O0.050.100.15表1 培养基优化正交试验因素水平Table 1 Orthogonal experimental factor levels for medium optimization试验号Experimentalnumble水平（Level）（%）A[蛋白胨]PeptoneB[甘油]GlycerineC[K2HPO4]D[MgSO4·7H2O]菌数（Bacteriumamount）（109cfu/ml）111117.01212225.25313331.834212318.585223110.92623129.927313211.428321325.259332123.00表2 培养基优化L9（34）正交设计及结果Table 2 L9（34） orthogonal design and results for medium opitizationA[蛋白胨]PeptoneB[甘油]GlycerineC[K2HPO4]D[MgSO4·7H2O]K14.7012.3315.6113.64K213.1413.8114.068.86K319.8911.588.0615.22R15.192.237.556.36优化组合Optimization-groupA3B2C1D3因素顺序FactororderA＞C＞D＞B表3 培养基优化L9（34）的极差分析Table 3 Range analysis of L9（34） for medium opitization2.2.1 时间对Xi-55发酵细菌数量的影响 每隔12h从摇床上取样，测定发酵液中细菌数量，绘制Xi-55生长曲线。结果显示（图1），在发酵0～12h 之间，菌体生长繁殖缓慢；12～36h 为菌体生长加速期，也为菌体繁殖高峰时期，发酵液内细菌数量明显增加；36～48h为稳定期，菌体数量基本稳定；60h以后为孢子衰亡期，活菌由于自身产生的分解物质而使菌体分解，发酵液变透明。根据该试验结果，36～48h为Xi-55适宜发酵时间。2.2.2 温度对Xi-55发酵细菌数量的影响 分别置于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃摇瓶培养，测定不同培养温度的生长量，结果表明（图2），28℃细菌数量最高，28～30℃细菌数基本稳定，低于28℃和超过30℃菌数明显下降。所以28～30℃为Xi-55适宜发酵温度。图1 时间对发酵菌数的影响Figure 1 Effects of time on the bacteria amount图2 温度对发酵菌数的影响Figure 2 Effects of temperature on the bacteria amount2.2.3 初始pH值对Xi-55发酵细菌数量的影响 设定pH值分别为5，6，7，8，9的培养基摇瓶培养，测定细菌生长量。结果显示（图3），当pH值为7时，细菌数量最高，当pH值为 7～8时，细菌数量基本稳定；pH值低于7和超过8，菌数明显减少；且 pH值为9或5时，菌体数量急剧减少或为零，据此推断pH值高于9或低于5时，Xi-55生长可能严重受抑制甚至不能生长，有待进一步研究。所以发酵培养基的适宜初始pH值为7～8。2.2.4 接种量对Xi-55发酵菌数的影响 分别采用0.5%、1%、2%、3%、4%等5个接种量梯度摇瓶培养，测定细菌生长量，结果显示（图4），接种量在0.5%～2%范围内，菌量数随接种量的增加而增加，接种量为2%时，菌量数最高；接种量超过2%，菌数明显减少。总体上来看，菌体生长量并非随着接种量的增加而增加，而是有一个限度。所以，2%为最佳接种量。图3 初始pH值对发酵菌数的影响Figure 3 Effects of initial pH value on bacteria amount图4 接种量对发酵菌数的影响Figure 4 Effects of inoculation amount on bacteria amount2.2.5 装液量对Xi-55发酵菌数的影响 采用装液量分别为50ml/500ml、100ml/500ml、150ml/500ml、200ml/500ml锥形瓶摇床振荡培养，测定细菌生长量，试验结果表明，通过摇瓶装液量的不同来调节通气量对Xi-55发酵菌数有较大影响。一定范围内，装液量越少，则通气量越高，氧气供应越充足，那么细菌数量就越高。50ml与100ml装液量差别不明显，但从总生长量考虑，100ml/500ml锥形瓶为最佳装液量（图5）。图5 装液量对发酵菌数的影响Figure 5 Effects of pack amount on bacteria amount在摇瓶优化发酵条件的基础上，进行了20L发酵罐的扩大培养。从生长曲线（图6）可以看出，发酵罐扩大培养的发酵周期与摇瓶发酵周期基本一致。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此，菌体浓度和芽孢同步形成率都明显优于摇瓶发酵。36h菌体数量达到最高量，50.61×109cfu/ml；然后进入稳定期，开始大量形成芽孢，44h形成芽孢90%以上。分析pH值曲线（图6）发现，初始pH值7.2，随着菌体生长，pH值缓慢下降；对数生长期菌体迅速繁殖，pH值也急剧下降，表明菌体大量利用养分产生了酸性物质；稳定期随着芽孢逐渐形成，pH值回升，44～48h时，芽孢数量达到最大；52h以后pH值上升至7.4左右，可以看到菌体碎片，细胞自溶，表明生长和代谢受到抑制。因此，发酵终止应在52h前，最佳放罐时间应在44～48h。图6 20L发酵罐中的生长与pH值曲线Figure 6 The growth and pH curve in 20L fermentation tank从以上试验可以看出，培养基的组成和时间、温度、培养基初始pH值、接种量、通气量、摇床转速等培养条件均对菌株的生长有很大的影响。通过单因子试验和正交试验方法，确定枯草芽孢杆菌Xi-55优化培养基为：蛋白胨3%，甘油1.0%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.15%；优化发酵条件为：时间36～48h，温度28～30℃，初始pH值7～8，接种量2%，装液量100ml/500ml锥形瓶，摇床转速180～200rpm。并进行了发酵罐扩大培养，36h达到生长高峰期，最适放罐时间44～48h；此时所获得的菌体数量约为50亿个/ml，为大规模工业化发酵培养提供了有益借鉴。在发酵过程中发现，发酵液的黏度较大，很容易产生泡沫，必须用消泡剂来消除。而本试验中采用的发酵专用含硅消泡剂CXX-910对pH值有轻微影响，故添加消泡剂不宜过多。操作时可预先在培养基里添加少量消泡剂，然后通过发酵罐上的补料装置在发酵过程中自行控制补充，这样可以在满足消泡的同时尽量降低消泡剂的添加量，减少消泡剂对pH值的影响，比一次性添加或单纯通过补料装置添加效果要好。

烟草青枯病是由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种细菌性病害，是烟草的一大毁灭性病害。此病主要分布于世界热带、亚热带及温带等湿热地区。我国烟草青枯病菌在长江以南发生居多，据报道，该病在多发病区旱地烟田的发病率为30%～50%。对烟草青枯病的防治，迄今仍无十分有效的措施，通常采用化学农药方法防治，但由于青枯病是维管束类病害，因而限制了化学农药的使用；而且化学防治易产生抗药性，造成环境污染。近年来，由于生物防治具有无污染、无公害、长效性等特点，所以青枯病的生物防治逐渐引起国内外的高度重视[1～4]。目前已取得了良好的进展，如魏春妹等[5]研制出番茄青枯病和烟草青枯病的生防制剂“青枯散”，田间试验证明该制剂对番茄青枯病、烟草青枯病有70%和80%的防治效果。为了筛选拮抗能力、定殖竞争能力强和效果稳定的优势菌株，本实验室从烟草的根标、根围土壤分离筛选出了拮抗细菌，并进行了室内拮抗能力的测定和盆栽烟苗防病的系列研究，得到了一株拮抗能力较好的菌株SH7，具有较好的商业化前景。本研究进行了SH7摇瓶发酵试验，筛选适合该菌株的发酵培养基配方和发酵条件。枯草芽孢杆菌SH7菌株由本室筛选、保存。种子培养基：牛肉汁液体培养基（酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、pH值7.0，定容至1L）。待测培养基的配制[6]：①号培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆粕1%；②号培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆粕1%、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1%；③号培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%；④号培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%、淀粉0.3%、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1%。将4种不同培养基pH值均调为7.2～7.3，装液量为60ml/300ml。121℃灭菌20min，备用。1.2.1 种子准备 牛肉汁液体培养基，pH值为7.0，装瓶量为100ml/300ml三角瓶，121℃灭菌20min。将牛肉汁液体培养基接菌后37℃过夜摇菌。1.2.2 培养基配方筛选 上述4种培养基中接种种子菌液1.5ml，在31℃条件下，摇菌36h后取5ml发酵完毕的菌液，在12000r/min下离心5min，倒掉上清，冷冻干燥沉淀18h后，称重量。1.2.3 发酵培养条件优化 每次只改变测定的一个发酵条件，其他方法同1.2.2。2 结果从表1可以看出，3次重复中5ml培养液中菌体干重的平均值大小依次为④号（0.0094g）＞③号（0.0089g）＞①号（0.0059g）＞②号（0.0054g），因此④号培养基较适合该菌的发酵。2.2.1 pH值 将发酵培养基的pH值分别调为7.0、7.3、7.6、7.9、8.2，3次重复。在装瓶量为60ml/300ml，接种量为1.5ml，31℃，180/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果为，pH值7.0为0.0081g、pH值7.3为0.0061g、pH值7.6为0.0079g、pH值7.9为0.0082g、pH值8.2为0.0092g。pH值8.2比较适合该菌的发酵（图1）。重量（g）①号②号③号④号10.00590.00510.00970.013120.00660.00530.00970.006230.00510.00380.00720.0090平均0.00590.00540.00890.0094表1 培养基配方筛选结果2.2.2 装瓶量 将发酵培养基的pH值分别调为8.2，接种量为1.5ml，在300ml的三角瓶中分别装入40ml、60ml、80ml、100ml、120ml，3次重复。在31℃、180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果为，40ml的为0.0065g、60ml的为0.0071g、80ml的为0.0065g、100ml的为0.0053g、120ml的为0.0062g。300ml的三角瓶中装60ml培养基较适合该菌生长（图2）。图1 pH值筛选结果图2 装瓶量筛选结果2.2.3 接种量 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量分别设为2%、4%、6%、8%、10%，3次重复。在31℃、180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。结果是，接种量2%的为0.0098g、4%的为0.0108g、6%的为0.0103g、8%的为0.0112g、10%的为0.0096g。较合适的接种量为8%（图3）。2.2.4 培养温度 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量为8%，将温度分别设为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃。在180r/min条件下摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，25℃为0.0087g、28℃为0.0107g、31℃为0.0112g、34℃为0.0099g、37℃为0.0106g。较合适的温度为31℃（图4）。图3 接种量筛选结果图4 温度筛选结果2.2.5 培养转速 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶，接种量为8%，温度为31℃。将转速分别设为120r/min、150r/min、180r/min、210r/min、240r/min，摇菌36h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，120r/min为0.0091g、150r/min为0.0109g、180r/min为0.0092g、210r/min为0.0107g、240r/min为0.0101g。150r/min比较适合该菌发酵，所以选定150r/min作为较适转速（图5）。2.2.6 发酵时间 将培养基的pH值调为8.2，装瓶量为60ml/300ml三角瓶、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，将摇菌时间分别设为12h、24h、36h、48h、60h，取5ml发酵液，冷冻干燥后称重。其结果是，12h为0.0038g、24h为0.0062g、36h为0.0063g、48h为0.0067g、60h为0.0063g。发酵时间36h和60h菌体重量相同，但48h菌体重量最大，发酵时间越长对于生产越不经济，所以选取48h为较适发酵时间（图6）。图5 转速结果筛选图6 发酵时间筛选结果为了确定最优的培养基配方，我们将摇瓶试验结果相对较好的④号培养基作为基础培养基（培养基中其他营养成分不变），从中选出4种主要成分，采用优化好的发酵条件，按正交设计表L9（34）设计了4个因素、3个水平的正交试验，以进一步优化培养基配比[7，8]。正交试验设计和结果见表2。由表中R值可看出，影响SH7菌量依次为：牛肉膏＞蛋白胨＞NaCl＞葡萄糖。正交试验结果表明最佳培养基组合为：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl。试验号牛肉膏（%）蛋白胨（%）葡萄糖（%）NaCl（%）菌体含量（g/5ml）1号1（0.3%）1（1%）1（1%）1（0.5%）0.009112号12（1.5%）2（1.5%）2（0.8%）0.010563号13（2%）3（2%）3（1.1%）0.011784号2（0.6%）1230.011445号22310.012566号23120.011897号3（0.9%）1320.011228号32130.012679号33210.01233Ⅰj0.03145g0.03177g0.03367g0.03400gⅡj0.03589g0.03579g0.03433g0.03367gⅢj0.03622g0.03600g0.03556g0.03589gR0.00477g0.00423g0.00189g0.00222g表2 正交试验设计及结果本文通过对该菌培养基配方和培养条件的优化选择以及正交试验，初步确定最适宜SH7菌株生长的培养基配方及培养条件如下：0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.1%NaCl；发酵起始pH值为8.2、300ml的三角瓶装瓶量为60ml、接种量为8%、温度为31℃、转速为150r/min，发酵时间为48h。这为SH7菌株的发酵罐放大试验提供了理论依据。本试验采用渐进法优化发酵条件，每确定一项，就在下一目标筛选中应用，这样使得得到的试验结果更准确。同时也要考虑到实际生产中的成本问题，例如某些营养物质含量不能太高或发酵周期不能过长，否则成本就会升高。众所周知，烟草业在国民经济中占有重要地位，目前青枯病的化学防治和生防都不甚理想，一定程度上制约了我国的烟草生产和出口。本实验室所筛选出的芽孢杆菌SH7对烟草青枯病菌表现出了良好的拮抗性，温室药效试验达到了较高的水平，前景广阔。本试验筛选出了适合该菌的发酵配方并优化了发酵条件，为该菌的生产应用打下了良好的基础。