长城润滑油前身是始建于1958年的北京煤炼油示范厂，是中国首个含氟润滑油脂的生产和研制基地；1982年成立长城高级润滑油公司，开始进入市场化发展轨道；2003年，中国石化润滑油公司与长城润滑油公司合并，使得长城润滑油成为中国石化润滑油业务主体。目前，中国石化润滑油公司集润滑油生产、研发、储运、销售和服务于一体，具备120万吨/年包装油生产能力，是目前国内最大高档润滑油专业产销集团，是全球第四大润滑油企业。长城润滑油品牌价值从1998年的1.5亿元逐年攀升至2008年的112.68亿元，2004年位居全国500强第68位，是润滑油行业唯一入选品牌。连续5年稳居中国润滑油行业第一品牌的位置。近年来，国内汽车工业等相关行业的快速发展，国外企业大举进入中国市场，促使国内润滑油市场的消费者构成、市场结构、消费模式、营销网络等发生了根本性变化，长城润滑油在市场竞争中遇到了许多新的问题，原有的竞争优势受到了挑战。润滑油行业是中国最早实现完全市场化运作的石化行业。国外大公司都力图通过润滑油业务树立自身品牌形象，为今后进入其它石化领域进行消费者认知上的准备。从1994年起，美孚、壳牌、埃索、加德士、福斯、日本石油等十几家跨国石油公司开始在中国投资建立20多家专业调合厂，总调合能力达到80万吨/年。国外石化企业依托雄厚的资金实力、灵活的营销手段，重点进行高端润滑油市场开发和品牌建设，逐步建立国外品牌质量更高、品质更好的品牌形象，目前占据着中国高档润滑油市场大部分的市场份额（图1）。图1 进口品牌在中国市场占有率面对广阔的市场空间，各润滑油企业纷纷引进先进相似的生产设备和生产工艺，不断增强竞争能力。从2002年开始，昆仑、统一开始进行大范围技术改造，先后引进自动化生产设施、管道调合设施，加强生产、物流的管理。竞争对手引入的新生产设备在工艺控制、生产柔性等方面达到长城润滑油的水平，使长城润滑油在生产体系方面建立的优势地位被削弱。近年来，中国润滑油市场向高档化发展的速度越来越快，SG、CF-4以上产品销售量快速成长，已逐步成为城市车用润滑油的市场主流。当润滑油市场主导产品开始向SG以上级别转移时，长城润滑油同类产品却在市场上表现不佳。长城润滑油渠道价格体系日益混乱。由于长城润滑油所建立的销售网络主要集中在批发流通领域，在长城润滑油不断增长的销售压力和长期反复的促销活动刺激下，产品销售价格变的十分混乱，经销商之间恶性竞争变得十分普遍。长城润滑油现有销售渠道主要是覆盖加油站、润滑油专卖店、零售店等传统销售终端，对日益兴起的汽车修理厂、汽车养护中心等销售网络覆盖能力严重不足。一是依托于中国石化，可在资金、科研、渠道等方面得到强力支持。二是掌握基础油资源，基本上能够实现基础油的供给自足，价格相对比较优惠。依托于燕山石化、高桥石化、茂名石化、荆门石化四大基础油生产基地的稳定供给，长城润滑油在I类基础油上基本实现了80%以上供给自足，质量上是过硬的。三是渠道优势。在长期发展中，长城润滑油已建立覆盖全国的销售网络。从2004年7月起，中国石化润滑油公司实施渠道整合，把旗下原销售渠道全部移交中国石化销售公司统一管理，采取总代理的营销管理模式，利用销售公司拥有的19个省级石油公司（其中9个地处沿海经济发达地区，2.8万座加油站遍布全国各地），形成了庞大销售网络。目前，中国石化润滑油公司以北京、上海、茂名、重庆、武汉五大营销中心为基础，形成了纵横南北、横贯东西、覆盖全国的营销网络。四是以中高档产品填补国内市场空白，树立起较高的品牌知名度和忠诚度。改革开放后，国内对SE、CD级别的中高档小包装润滑油需求开始出现。当时国内其他企业还停留在SB、SC、CA、CB等较低级别的散装油品生产上，国外品牌只能以产品进口的方式进入中国市场。长城润滑油抓住这一商机，率先进行高档小包装SE、CD产品的生产，填补国内市场的空白。20世纪90年代以来，长城润滑油依托在这两个产品上树立的优质形象，实现了稳定发展，基本上树立起“国货精品”、“质量可靠”的品牌形象（图2）。图2 品牌产品总体满意度对比（得分）五是拥有较高的市场占有率。2002年，中国石化润滑油公司对旗下分散经营的润滑油品牌实行统一管理，集中资源打造强势长城品牌。在完成润滑油业务专业化重组后，长城润滑油市场销售量稳步上升，2003～2007年，年销量由99.67万吨逐年提升到131.61万吨，稳居中国市场第一位，其中中档产品市场占有率达到40%。六是合理的生产布局。目前，长城润滑油已在全国建立9个生产基地，分布在以北京、上海、武汉、广州、重庆为中心的地区，布局比较合理。一是长城润滑油尽管有比较高的品牌知名度，但整体品牌形象不足，消费者普遍认为长城润滑油只是国产第一品牌，与壳牌等国际品牌相比，仍有一定差距。特别是在高档润滑油市场上，长城润滑油的认同程度仍然比较低（图3）。二是终端影响力不足。尽管长城润滑油建立起覆盖全国的销售网络，但长城润滑油对渠道的掌握更多集中在一、二级分销商上，在终端市场上更多的是依靠分销商进行开发和维护，长城润滑油对终端缺少足够的影响力，与国外品牌存在比较大差距（表1）。图3 国内各大品牌知名度比较大众消费者市场（CMMS）高端消费者市场（H3）排名品牌消费者份额（%）品牌消费者份额（%）1壳牌20.04壳牌31.752美孚18.46美孚14.523嘉实多9.68嘉实多11.264长城8.14长城10.11表1 2006年车用润滑油市场消费者份额第一，市场快速发展。近年来，我国汽车特别是乘用车发展迅速。2007年全国汽车年销量超过800万辆，汽车保有量突破5000万辆。2008年上半年汽车产销量双双突破500万辆，分别达到519.96万辆和518.22万辆，同比分别增长16.71%和18.52%。其中，私人购车快速增加，特别是私人载客车辆增长迅速，成为推动市场发展的主要动力。专家预测，轿车销量每增加100万辆，每年就会增加润滑油需求9.1万吨。2007年，中国市场仅车用润滑油年需求量就在200万～300万吨。跨国咨询公司克莱恩发布的《2009中国润滑油市场上的商业机遇》报告指出：中国润滑油市场在未来5年内将以每年10%的速度增长，预计到2020年，中国的润滑油消费量将超过美国。第二，消费者对国产品牌逐步认同。2002年以来，长城、昆仑等国产品牌不断进行品牌建设，在整个国产品牌的共同努力下，润滑油消费者对国外品牌的盲目崇拜现象得到了明显改变，越来越多的消费者开始认同国产品牌。第三，新兴终端的兴起给长城提供了同等机会。汽车连锁维修企业、养护企业作为新兴的销售终端，将在润滑油销售中发挥越来越重要的作用，从而使原有的市场格局发生根本性改变，使得众多润滑油企业重新站在同一条起跑线上，为长城润滑油赶超国外品牌提供了机会。首先，汽车制造商、设备制造商将掌握更大的发言权。由于汽车制造商、设备制造商指定用油、推荐用油对消费者有着越来越重要的影响，这些设备制造商在与长城润滑油的合作中将掌握越来越大的发言权。其次，新兴终端的兴起改变了润滑油渠道结构。终端地位的突出，特别是随着连锁型汽车养护、维修企业的日益发展，润滑油的销售将越来越受制于终端企业，长城润滑油原有的以加油站、专卖店、零售店为主体的渠道作用将日益减弱。同时，渠道扁平化的要求也使得长城润滑油原有的四级渠道模式受到挑战。再次，国际石油价格持续居高不下。石油价格持续走高以及国内成品油价格的持续上涨，使得基础油供应形势日益紧张，长城润滑油在外购尤其是Ⅱ类及以上的高档基础油资源上将遇到更多阻力。最后，市场竞争日益激烈。随着中国石化市场的全面放开，越来越多的国际石化企业将进入中国市场，相应地，更多具有雄厚实力的润滑油品牌也将加入竞争者行业，国内的润滑油市场竞争将成为国际化企业之间的竞争。主要包括：为汽车商提供原厂装填用油，即汽车出厂时所加注的润滑油，虽然只是一次性使用、数量较少，但对引导消费者今后对润滑油的选择有重要意义；提供汽车制造商服务站用油，即为汽车制造商所建立的特约维修服务站体系提供专用油品，这部分产品的使用量比较大，也是各润滑油企业争夺的焦点；获得汽车制造商的用油品牌指定，即取得汽车制造商在其车辆维护要求中明确指定或推荐使用长城润滑油的权利；建立全面的战略合作关系，包括为汽车制造商提供全面、系列的润滑产品，为其设计成本最低的油品供应、采购、使用方案，联合进行针对性的产品开发等。营销渠道调整的重点是将长城润滑油现有的以经销商（批发商）为重点的渠道结构转变为以终端商特别是汽修厂等终端为重点的渠道结构。将营销网络建设的重点从区域性批发网络建设转移到零售终端建设，加强终端掌控和信息沟通力度，搭建一个可以直接服务于用户，能够快速沟通信息的平台，以保证各项营销政策的顺利实施。针对销售终端多样性的局面制订差异化的销售政策，转变现有批发商职能。第一种是引导批发商转变为配销商，生产厂家、配销商和销售终端之间通过契约或合资等方式建立一种产销同盟，由配销商承担日常销售和物流配送职能，厂家则专注于市场开发和市场维护。第二种是与资金、管理实力强的经销商合作，利用其原有客户群，依靠产权合作或加盟连锁的方式，组建以合作经销商为龙头的专业换油维护网点联盟，将批发商转变为连锁企业。第三种是全程协助经销商实行深度分销。主要是通过设置市场协销人员，指导、协助经销商进行所属区域内的终端网络的开发和维护，借助经销商的力量实现在广大城乡、农村市场的深度开发。第一种方式，长城润滑油可自行投资建立自有品牌的汽车维修养护企业。这种方式的优点是长城润滑油可以实现对汽修企业的完全控制，使之有效服从于长城润滑油的整体发展需要，同时可以取得比较高的经营利润。其缺点是长城润滑油进入并不熟悉的新业务领域，缺少相关的人力资源和管理经验，并且独资兴建的成本投入比较高，扩张的速度比较慢。第二种方式，长城润滑油以资金投入参股的方式，介入其他汽车连锁养护企业，以股东形式出现。这种方式的优点是可以利用其他企业的已有资源，资金投入比较少；可以由更专业的人士经营管理，避免长城在不熟悉的领域竞争。但缺点是合作方之间会出现冲突。第三种方式，互相提供支持和帮助，以契约或共同利益为纽带进行合作。如长城润滑油提供产品、技术、服务上的支持，共同进行双方品牌的传播等。这种合作方式比较灵活，但缺点是控制力比较弱，特别是随着汽车养护企业地位的不断增强，当双方出现冲突时，长城润滑油的利益很容易受到损害。从长城润滑油的整体战略要求来看，进入汽车养护领域更多的是要解决未来长城润滑油在终端渠道的销售问题。因此，长城润滑油可以更多的采取参股方式，建立与汽车养护企业的合作，避免独自进入不熟悉领域的风险。长城润滑油在高档市场的品牌认知不足和品牌形象不高始终是制约其在高档市场实现快速发展的原因之一。在建立长城润滑油产业链的过程中，应当及时提高长城润滑油在高档市场的品牌形象。实施整合营销传播，通过持续稳定的向消费者传递长城润滑油的品牌和品质信息，扩大长城润滑油的品牌影响；与昆仑等国内品牌合作，共同提高消费者对国产品牌的认同，继续消除消费者对国产品牌的偏见；加强与终端合作，提高终端的推荐力度。通过有效的激励措施，如提供奖金奖励等，促使销售终端的汽车修理工进行长城品牌推荐；同具有品牌影响力的汽修企业合作，借助对方品牌形象扩大自身影响。

民营企业创业初期，找到挣钱的项目后，企业飞速发展的表象掩盖了内部经营管理不足的问题，但高利润期是不可能永久持续的，进入平缓期要求企业必须向规模化发展。此时，企业引入专业化管理人才，希望借助其丰富的管理知识和管理经验，带领企业走向辉煌成为必然趋势。民营企业职业经理人就应运而生。于是，通过朋友的介绍、从同行业中挖取墙角或者猎头公司为中介，成为民营企业老板谋求职业经理人的几大手段。然而，这些并未真正解决企业发展中心诸多“瓶颈”，因为职业经理人自产生起就存在方方面面的问题，因此，如何正确引进和运用职业经理人成为目前民营企业的必修课。企业发展到一定的规模之后，企业家的管理半径不能辐射到整个企业，管理就出现了漏洞和空白区，前期发展过程中潜伏的问题和危机就会逐渐浮出水面。在文化背景上，民营企业家大多文化水平相对较低，尤其是一些家族式的民营企业。而职业经理人文化水平普遍较高，很多还接受过西方教育，熟悉西方的管理理念。由于文化背景的差异，在企业内往往带来一些管理上、机制上的矛盾。目前，中国民营企业老板和职业经理人都普遍缺乏良好的职业道德。企业老板在保持自己对整个企业的掌控权时，要求职业经理人在短期内带来丰厚的利润。而职业经理人又习惯了公众对他们的仰视，他们的不足愈发加重了他们的生存压力以及对资本意志的屈服。他们对未来普遍有一种难以把握的恐惧，这就不可避免地造成职业经理人对老板的戒备，而这种戒备与恐惧心态的极端表现促使其职业行为的严重扭曲。没有良好的管理环境：由于中国市场还不规范，特别是法制环境不健全，道德环境不成熟，现阶段中国还不具备形成职业经理人阶层的条件。特别是管理不成熟，缺乏运作平台，造成职业经理人需要付出更多的艰辛和更大的代价，既要谙熟企业规则和技巧，又要积极适应中国企业的现状。一些民营企业的企业主不愿以股权或期权作为有效的激励机制，甚至降低已约定的工资报酬，奖励机制不能真正到位，造成职业经理人的波动与流失。而职业经理人方面，经理人一碰到不如意、遭遇企业低潮，或者竞争对手高价招手，就拍屁股走人，损害了原企业形象和客户关系，造成民营企业的资产流失。企业主和职业经理人之间这种信托关系会因多种因素的影响而使私营企业主与职业经理人之间产生差异，导致二者互不信任。民营企业想要持久发展，走向良性发展的道路，不解决经营权和所有权的问题，实现职业经理人制度，就无法实现真正的专业管理，企业最终还是难以突破管理瓶颈。所以，企业需要解决以下现实问题：一是是否需要引进职业经理人。要根据公司规模、机制的成熟度、对职业经理人的认识程度，来思考是否聘用以及聘用什么样的职业经理人。如果企业的内部管理体系本来就不成熟，存在着先天的或者是由于客观原因造成的严重得难以克服的问题，在这样的情况下，即使聘用职业经理人也无法力挽狂澜。二是以正确的态度对待职业经理人。职业经理人可以为企业带来新的思维方式、新的管理理念和先进的信息资源。他们多数时候可以将企业的具体经营战略付诸实施并取得实效，但有时也不可避免一些决策失误和重大偏差。而应该抱着宽容客观的态度，辅之以必要的约束和防范机制，让职业经理人在心灵深处建立以事业为目标、以诚信为纽带、以发展为动力、以共创辉煌为企盼的与企业同生共荣的信念，避免因缺乏沟通造成反目为仇的结果，给企业酿造无穷的危机。三是民营企业应注重自身的人才培养。目前，国内的职业经理人阶层还有待形成，企业应该充分发挥自身的作用，注重自身的人才培养的投入，重视人力资本的比较优势，从而在其职权范围内，按照企业的战略发展目标，肩负起领导和设计本组织许多变革和改革的重要任务，有效避免因决策不当而造成财力和人力资本的浪费。四是建立有效的激励机制。对职业经理人的激励可以分为短期激励、长期激励和特殊激励。短期激励是指根据职业经理人当年业绩目标的完成情况和能力发挥情况的综合考核，每年按年度兑现的激励；长期激励是指公司为实现既定的长期战略目标对优秀职业经理人未来若干年安排的激励措施，以吸引优秀的职业经理人长期工作，避免流失。特殊激励就是实行合伙制，公司股东会对于特别优秀的、做出巨大贡献的职业经理人，邀请他们成为新股东，作为合伙人，共享企业发展的美好明天。这个问题看似不难，但很多企业的老板一开始并不知道自己的真正需求是什么？譬如公司产品的销量和利润都下降了，市场管理出现问题了，这看上去好像只要一个营销总监就可以了。但真实的情况往往不是这样的，要仔细深挖下去，找到出现问题的真正原因，然后才能确定是不是需要引进这么一个营销管理高手来解决企业的问题，也可能有些表面上的营销问题，其实是内部管理体系的混乱引起的。营销高手来了可能也解决不了实际问题。人品绝对比专业能力更重要，这个问题无可非议。要了解一个人的人品可以通过他（她）原先的工作单位及同事进行调查获得；同时要仔细查明对方看中的是高薪水？还是企业的前途？或者老板的个人魅力？是不是有其他的想法？有的职业经理人口头表达能力高于实际工作技能，面试时有意隐藏自己的真实意图，这就使选择者会作出错误的选择。能力有多方面的，在弄清楚前两个问题之后，其实很容易查明对方的工作能力，譬如人力资源总监人选，除了专业学历以外，一定要调查他以前工作的单位领导和员工对他的评价，他本人在这方面的观点以及某些成功的案例。假如是营销总监人选，除了要看他的理论素养和实战能力以外，还要看他的综合协调能力、跟上下级的沟通能力以及带队伍的能力。把合适的人放在合适的岗位，这是许多老板都懂的道理。但事实上我们做起来往往不能尽如本意。有的老板，因为过度信任而把公司的全部权力交给经理人一个人掌握，导致其能力的局限而出现管理问题。所以，经理人上任以后，要明确他的职权利，规定他的管理范围，同时建立与老板的定期沟通机制和汇报总结制度，使经理人自己的工作有明确的方向，也不至于完全失控。企业应从内部着手强化委托代理的约束和激励机制，实现委托代理机制和民营企业的有效融合，努力降低委托代理机制的运行成本，使其成为一项内生性制度安排。具体而言，就是要让委托代理机制的设计既使职业经理人的个人利益与民营企业利益的战略选择趋同上发挥其应有的激励约束作用，又从制度和具体的管理措施上有效防范职业经理人阶层的道德风险问题。建立章程约束、合同约束、组织机构约束、法律约束、道德约束等。综上所述，民营企业想要走向良性发展的道路，应实现职业经理人制度，企业对经理人信任，经理人对企业忠诚。作为一段历史的进程，将来，我们一定会欣喜地看到职业经理人与中国民营企业密切合作的双赢局面。

全球化浪潮的兴起预示着一个新时代的来临，管理学大师彼得·德鲁克指出：在这样的时代里，“唯一关键的事情就是创新”。技术创新在现代社会有重要的意义。对企业而言，技术创新是提高竞争优势的主要途径，是企业参与竞争的主要手段，创新能够创造差别，使企业能够寻求新的竞争机会，并据此而获得差别优势和利益。改革开放以来，中国在国际经济舞台上的迅速崛起令世人瞩目，我国企业的生存与发展环境发生了巨大的变化，在赢得众多发展机会的同时，亦面临极为严峻的考验。竞争和创新也使市场更为动荡，人们越来越清醒地认识到，技术创新能力的培育对企业获取竞争优势的关键作用，从而迫使企业要不断地开展技术创新。何谓技术创新？有人定义创新为发明加开发，换句话说，它不只是发明创造活动，还包括把产品推向市场并销售给人们的活动。因此，技术创新是科技新设想转变成一种新的或改进的新产品或新工艺，并把新的或改进的产品、工艺、物料或服务开发并转移到它们适合的工厂或市场的过程。企业核心竞争力，是近几年来企业界谈论最多的话题，也不乏有一些理论性的研究和观点上的争论。“核心竞争力”这一术语首次出现是在1990年，著名管理专家C.K.Prahalad和Gary Hamel在《哈佛商业评论》上发表的《企业的核心竞争力》（The Core Competence of the Corporation）中指出：“核心竞争力是在一组织内部经过整合了的知识和技能，尤其是关于怎样协调多种生产技能和整合不同技术的知识和技能。”按照Prahalad和Hamel的定义，企业的核心能力有三个基本特征：核心能力提供了进入多样化市场的潜能；核心能力应当对最终产品中顾客重视的价值作出关键贡献；核心能力应当是竞争对手难以模仿的能力。那么，所谓核心竞争力就是指蕴涵于企业内质中的，支撑企业过去、现在和未来竞争优势的，并是企业长时间内在竞争环境中能取得主动的核心能力。Prahalad和Hamel提出了一个“树形”模型来解释核心能力：企业是一棵枝叶繁茂的大树，其最终产品是果实，最终服务是叶子，树枝是结合产品和服务的战略业务单位，树干和主枝是核心产品，为整棵树提供和输送养分，维系生命的根系就是企业的核心能力。这一模型是要表明核心能力与核心产品相关联，但是这种关联不是因为企业有自己的核心产品，因此相应的技术和技能就成为核心能力，而是强调以核心技术和知识为基础的核心能力导致了企业的核心产品。这一模型还表明了核心能力主要是一种和价值创造过程直接相关的技术能力，只有构成企业主体部分的价值创造活动中的能力才能带来实际的价值，并通过企业的产品或服务来体现。因此，技术创新能力是企业核心能力的根基。核心竞争力以企业核心技术能力为核心，通过企业战略决策、产品制造、市场营销、组织管理以及企业文化的整合而使企业获得长期竞争优势。而企业核心技术能力又在于不断创新。在经济全球化的市场经济体系下，企业所面对的市场不再是一个国家或一个地区，而是全球化的市场，企业今天的核心技术不等于明天的核心技术。因此，只有通过不断的创新，才能保证企业的技术始终走在科学的前沿，才能成为企业的核心。因特网搜索引擎技术的发展历史让人们充分体会到竞争环境变化之快，也证实了保持竞争优势有多么困难。1994年出现了第一个搜索引擎EINet Galaxy，它是“Yahoo！”搜索技术的基础。但是，90年代末期，在该领域Google就取代了Yahoo！的主导地位，现在其他的竞争者通过更多的链接以及能够浏览更多的页面向Google发起冲击。手机公司也同样面临快速变化的市场模式。1998年，诺基亚是手机生产商家的领军者，到2002年，诺基亚在市场中落到了第四，三星成为彩屏手机的领导者。但是在2003年，诺基亚凭借带摄像头的手机打入市场，再一次成为了该领域的领军人物。我们可以看到，获取持续竞争优势需要付出多年的努力，而要在超竞争的环境中保持竞争优势则更加困难。技术是竞争优势的来源，如何把企业的技术能力转换为竞争优势更为关键，那么技术创新就是联结技术能力和竞争优势的纽带。经济发展的现实已经证明，技术创新一直是整个历史上产业发展、生产率增长以及人们生活水平不断上升的强大动力。技术创新可能是使竞争对手之间市场份额发生重大变化的唯一的最为重要的源泉，它还可能同时是造成占有牢固地位的企业死亡或让位的最经常的原因，因为它能够创造或破坏企业的利润。技术创新还常常能创造新的产业，并且能改变或摧毁现有产业。简而言之，技术创新就是现代企业竞争环境中最具决定性和毁灭性的力量。因此在市场竞争日趋激烈的今天，企业要想求得生存与发展，必须加强技术管理与技术创新管理，以提升企业的核心竞争力。技术管理与技术创新管理已成为成功企业的一种新特征，其成功之处不是对已存的人、财、物和信息资源的管理，而是对自己独特的技术资源的管理，是对企业技术创新体系的建设。技术管理的关键不是要员工在职能管理的体制下各司其职，最大效率地完成其分担的工作，而是要创造一种机制和氛围，是企业员工个人及组织的技术创新能力能够最大限度地发挥出来。而创造竞争优势则需要开发和利用企业中的技术，包括企业员工的知识、技能和思想的交流，也包括历史和现有技术的应用。企业的技术管理最终能够达到提高企业核心竞争力的目标。创新是一个民族进步的灵魂，是国家兴旺发达的不竭动力，毫无疑问也是企业发展的不竭之源。企业应通过技术创新提高产品的独创性。一个行业，一个企业，如果没有持续不断的科技创新，就没有发展的源泉。企业的技术创新体系，通常以一项核心技术或几项关键技术为核心，企业的核心竞争力往往就体现在这些核心技术的开发和利用上。于是就有了这么一个逻辑：企业核心竞争力——企业自主创新——企业的生存与发展。在思考这三者关系时，企业的生存与发展是作为企业经营者最为关心的，是工作的目的；企业自主创新是方法、是手段；而企业的核心竞争力则是能力、是根本。即：企业经营者通过技术创新和产品创新等来把握和培育好企业核心竞争力，以达到企业发展的目的。只有源源不断地技术创新，企业才能不断向市场推出新产品，不断提高产品的知识含量和科技含量，改进生产技术，降低成本，进而提高顾客价值，提高产品的市场竞争力和市场占有率，并适时开拓新的市场领域。跨国公司都非常重视技术创新，设有专门的研发部门，并不断加大对技术创新的投入，以此增强企业的创新能力。据统计，世界500强的研发投入占销售收入的比重平均为5%～10%，大大高于中国企业的平均比重。2001年当国内各彩电品牌在大打价格战时，沉寂多年的索尼在中国市场仅50万台高端彩电的销售量所获得的利润就相当于国内所有彩电品牌的利润总和。“技术的索尼”的威力显露无遗。与国外知名企业相比，中国企业普遍存在的一个问题便是对技术创新不够重视，忽视对新技术、新产品的研发投入，在研发方面的投入过低自主创新能力不强，而满足于以设备制造商方式赚取微利，动辄打“价格战”。由于历史原因，中国的许多企业还未从计划经济时代“生产工厂”的角色中完全脱胎出来，很多企业没有专门的研发部门，对技术创新的投入长期处于很低的水平上，这就直接导致了当前中国企业自主创新能力普遍较差的局面。因此我国企业必须制定技术创新战略，建立符合技术创新功能要求的组织机构，建立保证技术创新顺畅运行、互相衔接、及时反馈的运行程序以及科学的现代管理，建立能够鼓励技术创新并在一定程度上自主控制技术的管理体系；并围绕与高校、科研机构联合攻关，或形成研发战略联盟，从而大大提高企业的技术创新能力，以提高企业核心竞争力。技术创新战略决定企业创新的具体行为。企业能否正确选择并贯彻实施良好的创新战略，是其能否顺利推进技术创新，赢得创新利益的先决条件。那么如何选择正确的创新战略是企业面临的重大问题，是涉及企业生存与发展的根本前提。由于技术创新活动主要源于市场拉动或技术推动及两者结合，因此技术创新活动一方面要立足市场，另一方面要把握科技发展潮流。由于全球化浪潮不以人的意志为转移地到来，要求企业及早地融入全球化环境中。借鉴国外企业创新战略的经验，下面几种创新战略可以供我国企业选择、探索。● 自主创新战略。自主创新战略是当今国际上一些成功的知识型企业为在竞争中取胜而较多采用的创新战略。它所需的核心技术来源于企业内部的技术突破，是企业依靠自身力量，通过独立的研究开发活动而获得的。对于自主创新的企业来说，在技术开发方面，由于能在一定时期内掌握和控制某项产品或工艺的核心技术，这在一定程度上左右了行业或产品技术发展方向；同时由于自主创新者一般是新市场的开拓者，因而可处于完全独占性垄断地位。● 模仿创新战略。模仿创新战略的核心是快速高效而特别的技术积累。首先，向成功的率先创新企业学习，模仿创新活动，快速而有效地增长创新知识和技能。企业的技术积累中包含大量暗默性的知识和技能，模仿却能够让一个企业在不解析原理和结构的情况下，有效地“复制”另一个企业的知识技能而丰富其技术积累，再在此基础上消化吸收，进行新的探索，而在技术积累方面青出于蓝而胜于蓝。其次，在模仿创新中实现高效的技术积累，再在高效的技术积累基础上将技术积累的重点后移，即将注意力和主要资源投入到工艺、批量生产、质量控制等环节，在这些方面形成丰厚的技术积累，从而建立起核心竞争能力。● 联盟创新战略。当今世界全球性的技术竞争不断加强，企业技术创新活动中面对的技术问题越来越复杂，技术的综合性和集群性越来越强，即使是技术实力雄厚的大企业也会面临技术资源短缺的问题，单个企业依靠自身能力取得技术进展越来越难。因此，以企业间的分工合作方式进行重大的技术创新，通过外部技术资源内部化，形成联盟以实现知识资源共享和优势互补，成为新经济形式下企业技术创新的必然趋势。通过联盟各方技术经验和教训的交流，集中各方智慧，能为参与联盟的企业赢得市场，带来经济效益，使知识增值，提高企业在市场竞争的地位。随着全球经济一体化，市场、制造全球化的发展，世界已经步入全球化新时代，为应对全球化竞争，我国企业走向全球化已势在必行。因此提高技术开发与创新能力，获取技术与竞争优势尤为重要，在全球范围内获取与保持持续竞争优势实现持续发展也成为重中之重。结合技术创新战略，企业有效地采取与实施全球化战略与管理是中国企业走向全球化、获取全球化发展的根本出路。

玉米是世界第三大粮食作物，在农业生产中占有重要的地位；也是我国北方和西南山区及其他干旱地区栽种的主要粮食作物之一。玉米生长过程中易受多种病虫为害，其中玉米丝黑穗病、瘤黑粉病和小斑病是广泛流行于各玉米产区的3种主要病害，近年来有不断传播蔓延的趋势。种子带菌是病害传播和流行的重要途径之一，了解北京地区玉米主栽品种种子带菌情况，以及种子带菌量和病害发生的关系，对防控这3种病害有着重要的实际意义。本研究以玉米种子为研究对象，筛选出适合检测3种病原菌的检测方法，检测了北京地区玉米主栽品种的带菌情况，并通过温室盆栽试验，初步研究了种子表面携带3种病原菌的负荷量和病害发生情况的关系。本研究比较研究了洗涤法、滤纸法、冷冻滤纸法和PDA培养法5种种子检测方法。结果表明，洗涤法适用于检测种子表面携带的玉米丝黑穗病菌和瘤黑粉病菌冬孢子；冷冻滤纸法和PDA培养法可以用以检测玉米小斑病菌。采用上述方法检测了北京地区7个玉米主栽品种的带菌情况，其中在京科25、农大3138、中糯301和高油4515这4个品种种子表面检测到了黑粉菌的孢子，不同品种的带菌率有所差异，高油4515携带瘤黑粉菌的菌量达到了421.1个/粒种子，丝黑穗菌的菌量为168.4个/粒种子；中糯301和高油4515还检测出带有玉米小斑病菌，带菌率分别为1.4%和1.0%，寄藏部位为胚乳；种子携带的其他真菌主要有镰刀菌属、链格孢属、枝孢霉属、曲霉属、青霉属和根霉属。在检测中我们发现，镰刀菌是种子携带的主要真菌，其中昌甜100（正交），高油4515品种中镰刀菌的携带量达到了105个/粒种子。已有相关研究报道表明，镰刀菌的携带量与种子的活力有关系，因此对于玉米种子携带镰刀菌的风险需要引起重视。选择感、抗和高抗3种抗性水平的玉米品种，采用浸种法在种子表面分别接种10个/粒、102个/粒、103个/粒、104个/粒和105个/粒5个浓度的3种病原菌孢子，温室条件下进行盆栽试验，结果表明，不同抗性的玉米品种接种系列浓度的病原菌孢子后发病情况不同：接种瘤黑粉病菌的处理中，感病品种中糯301在接种量为103个/粒时，抗病品种农大108在接种量为105个/粒时，而高抗品种郑单958在接种量为106个/粒时才分别开始发病；接种丝黑穗病菌孢子的处理与上述结果相近，感病品种中糯301在接种量为103个/粒时、抗病品种农大108接种量为106个/粒时开始发病，而高抗品种郑单958在所有接种量均未发病。接种小斑病菌的各处理没有病害发生，分析原因应该与病害的发生规律有关，小斑病是一个典型的气传病害，种子带菌不容易直接导致病害的发生，但是种子带菌会有增加田间初侵染的来源，同样有造成病害流行的风险。

稻曲病Usitilaginoidea vriens是影响水稻产量及品质的重要穗部病害。稻曲病厚垣孢子可以侵染水稻，引起稻粒发病[1，2]。陈永坚[2]用室内越冬的厚垣抱子接种水稻种子、芽鞘、苗期叶片、秧苗根系，穗苞均可引起稻曲病的发生，说明稻曲病很有可能在种子萌发或插秧时已侵染水稻，水稻生长后期穗部发病，是一种系统性侵染病害。也有研究认为稻曲病不是系统侵染的病害[3，4]。为进一步明确稻曲病的侵染方式问题，有必要用更严谨的试验加以研究，为稻曲病的防治及抗源筛选提供的理论指导。于2007年8月1日在湖北省宜昌市远安县莲花镇进行套袋试验。莲花镇海拔510m，峡谷地貌，7、8月份日平均温度低于30℃，8月份降雨量超过212mm，是稻曲病的重要疫区，田间累积了大量的厚垣孢子。供试水稻品种为“粤优938”，在水稻圆杆拔节期，用40cm×10cm的纸袋套住单株水稻，以避免田间厚垣孢子的自然侵染，套袋共计68穗，于水稻乳熟期回收套袋稻穗并逐一检查稻曲病的发病情况。1.2.1 供试菌源 将4℃保存的2006年中稻“粤优938”上采集的稻曲球粉碎后，用2%的蔗糖溶液配置为厚垣孢子悬浮液A，置于28℃的培养箱（LRH-250型，广东省医疗器械厂）中保存24h备用；将2007年采集的早稻“金优402”上的稻曲球，粉碎后用2%的蔗糖溶液配置为厚垣孢子的悬浮液B，过滤后加入少量土温-20，在涡漩振荡器上振荡5分钟，在28℃条件下保存24h。以上厚垣孢子悬浮液在100×显微镜下一个视野内有约1000个厚垣孢子。1.2.2 供试水稻 2007年5月9日将水稻种子“粤优938”在自然日光下暴晒8h后用杀菌剂浸泡72h，然后置于培养皿（φ=9cm）内在28℃培养箱（LRH-250型，广东省医疗器械厂）中催芽，72h后播种育苗，2007年6月8号移栽插秧。1.2.3 方法 试验地点位于湖北省农科院网室内，网室周边农田环境中没有稻曲病疫情发生。试验用土壤经200℃电热鼓风干燥箱（HN101-1型，南通沪南科学仪器有限公司）灭菌1h后，分装入瓷盆（φ=25cm，h=32cm）中备用，瓷盆置于聚乙烯薄膜棚（长×宽×高=4×3×1.5m）内，棚顶敞开，用遮阳黑网覆盖。供试水稻做作以下处理：1）种子带菌：经消毒后的种子催芽时用少量厚垣孢子液A浸泡，2007年6月8日移栽入装有无菌土的瓷盆中。2）根部带菌：年6月8日插秧时，用清水洗净秧苗根部，在厚垣孢子液A中浸泡8h后移栽入装有无菌土的瓷盆中。3）穗期接种：2007年9月4日下午6时，将处于破口或杨花初期的水稻用手提猴头喷雾器在穗部喷雾接种厚垣孢子液B，喷雾后用聚乙烯薄膜将稻穗封闭保湿48h。4）不做任何接种处理。以上每处理2个瓷盆，每瓷盆内3兜水稻，分蘖后期每瓷盆内水稻有30～40株。水稻生长期正常管理，同时在水稻孕穗期以后，每天喷水两次，保持环境的湿度，同时观察记录稻曲病的发病情况。田间套袋试验结果：在水稻乳熟期回收的68个套袋稻穗中发病稻穗有38个，病穗率为55.9%，按照唐春生[5]的病情分级标准，病情指数为24.58。网室盆栽试验结果：在水稻灌浆初期，浸根处理的水稻首先发病，稻粒内外颖壳接缝处出现白色的菌丝团，逐渐长成白色球状物，形成稻曲球，4d后露出黄色的厚垣孢子，厚垣孢子颜色由鲜黄色逐渐转暗。浸根处理发病一个星期后种子带菌及喷雾接种处理都开始出现稻曲球。种子带菌、根部带菌及破口期喷雾接种带菌的病穗率分别为：25.0%、1.6%、5.8%。王国良[1]认为稻曲病厚垣孢子主要在水稻破口前1～4天至破口时从水稻柱头侵入引起发病。本次田间套袋试验中，在水稻圆秆拔节期用纸袋隔离了田间厚垣孢子的自然侵染，但后期调查病穗率仍高达55.88%，说明稻曲病厚垣孢子在水稻生长早期可能已被上年累积在田间的厚垣孢子侵染。在网室试验中对土壤及种子都进行了严格消毒，土壤中无自然存在的稻曲病厚垣孢子；试验中对照没有发病排除了种子自身带菌的情况。在水稻育秧及移栽以后的生长阶段都实施了隔离措施，避免了未知自然侵染对结果的干扰。试验中无论是水稻营养生长期还是生殖生长期接种，在水稻生长后期都出现了稻曲病粒，而且试验结果以厚垣孢子接种水稻种子的发病率最高，进一步说明了厚垣孢子在水稻生长早期侵染的可能性。试验中接种水稻种子所用的厚垣孢子源于2006年的中稻稻曲病粒，穗部接种菌源是2007年早稻病粒，说明上茬水稻上的稻曲病厚垣孢子可能是田间的重要侵染源。以上两试验结果表明稻曲病厚垣孢子侵染水稻的方式至少包括两种：1）系统侵染：土壤中或依附于种子表面的厚垣孢子，在水稻种子萌发初期侵入水稻胚内或在插秧时侵染水稻根部，灌浆期出现穗部病症；2）局部侵染：在水稻孕穗期，直接侵染穗部，灌浆期发病，而且以系统侵染为主要侵染方式。因此郭荣华等根据水稻穗部接种的结果及王国良的试验结论认为稻曲病不是系统侵染病害值得商榷。王疏等[6]用Nested PCR方法成功检测出水稻生殖生长期稻曲病在植株茎秆、穗部的分布特征，为研究稻曲病的侵染提供了分子生物学方法。故对于本次试验中水稻材料，可以用分子生物学手段检测水稻不同生长期稻曲病菌在水稻根部、茎秆、叶片及穗部的分布情况从而进一步明确稻曲病的侵染方式。

Keywords:Magnaporthe grisea;pathogenicity;T-DNA insertional mutants;gene function稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr.，无性世代为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc.]侵染水稻引起的稻瘟病是水稻“三大病害”之一[1，2]，严重限制世界水稻产量，但迄今为止对其致病性及其变异的机制了解得仍然不够透彻。已知水稻与稻瘟病菌之间的特异性互作，符合Flor提出的“基因对基因”关系假说[3]。对稻瘟病菌无毒基因的研究，将有助于进一步了解稻瘟病菌致病性变异的机制以及水稻与稻瘟病菌之间分子水平特异性互作的机制。目前，通过遗传分析或分子标记技术，已鉴定了至少30个稻瘟病菌无毒基因[4～7]，其中仅有5个无毒基因（PWL1、PWL2、AVR1-CO39、AVR-Pita、ACE1）被克隆[8～12]。此外，稻瘟病菌的侵染过程是一个错综复杂的循环过程，涉及一系列形态结构与生理生化的变化，故而除了无毒基因之外，与稻瘟病菌致病过程有关的基因的研究也是研究者关注的焦点，目前已经克隆和分析了包括MPG1，CPKA1，PTH11，PMK1，MPS1，MAGB，MAC1，PDE1，PSL1，TPS1等40余个参与稻瘟病菌生活史各个阶段的功能基因[13，14]。稻瘟病菌基因组全序列测定已经完成[15]，伴随着生物信息学的飞速发展，进一步以功能基因组学的研究方法从全基因组水平研究水稻与稻瘟病菌之间特异性互作的分子机制、诠释关键基因的功能已经成为解决持久抗瘟问题的关键所在。本研究正是通过接种筛选本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054 B T-DNA插入突变体库，获得致病性变异稳定的突变体，运用TAIL-PCR方法获得了突变体被T-DNA标记的侧翼序列，并通过一系列表型分析、分子生物学实验及生物信息学分析初步分析了T-DNA插入区域的基因功能，为进一步获得相关病菌小种的无毒基因或与致病性相关的基因奠定良好的基础。稻瘟病菌菌株FJ95054B，是本研究的野生型对照菌株，由本实验室从福建田间单孢分离得到的菌株；供筛选的突变体菌株，是随机从本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库中抽取的。供接种筛选的水稻品种CO39近等基因系：C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b及感病对照CO39，由国际水稻研究所提供。稻瘟病菌菌株的活化、扩大培养及产孢方法参照王宝华等[16]，育苗及接种方法参照张学博等[17]。接种后8～10 天，采用目测法调查并记载各品种水稻叶片上的病斑反应型。病斑反应型的记载标准参照Valent等[18]的方法，具体分级标准如下：0级：无病斑；1级：只有针尖大小的褐色斑点（病斑直径可达0.5cm）；2级：直径约0.5～1mm褐色病斑，病斑有明显黄褐色中心；3级：直径约为2mm的褐色眼状病斑，中央灰色，边缘褐色；4级：长约3～4mm中等大小的灰色梭形病斑，边缘褐色；5级：病斑达到最大（CO39的眼状病斑最长约为5mm），甚至多个病斑连片，叶枯死，如出现暗绿色急性病斑或叶节瘟也属于这一类型。其中，0～2级记为抗病反应，3～5级记为感病反应。参考李宏宇方法[19]，观察所获得突变体的形态特征及其生长发育过程，记录菌落直径、产孢量、孢子萌发率、附着胞形态和形成率以及洋葱表皮侵入情况。稻瘟病菌基因组DNA的提取参照何月秋方法[20]。TAIL-PCR反应使用的T-DNA左、右边界嵌套引物为：LB1：5'-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG-3'；LB2：5'-CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT-3'；LB3：5'-GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT-3'；RB1：5'-GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'；RB2：5'-AACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-3'；RB3：5'-CCCTTCCCAACAGTTGCGCA-3'。使用的随机引物为AD7：5'-TG（A/T）GNAG（A/T）ANCA（G/C）AGA-3'；AD9：5'-TCGTTCCGCA-3'；AD12：5'-（A/T）AGTGNAG（A/T）ANCANAGA-3'。以上引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。10×PCR Bufer、dNTP、rTaq酶均购自宝生物公司（TAKARA）。TAIL-PCR反应程序参考文献[21]。将TAIL-PCR第2、3步扩增产物用0.5×TBE制备1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳电压为5 V/CM。电泳结束后，将凝胶放入含EB的0.5×TBE 中染色20～30min，用紫外透射反射仪观察并照相记录。TAIL-PCR扩增产物通过电泳分离后，回收目的片段，纯化后与pGEM-T Easy Vector（购自Promega公司）连接；连接产物通过热激转化到DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑反应初筛转化子；采用碱裂解法少量提取转化子中的质粒DNA，通过PCR及酶切鉴定，挑选。将含正确插入的转化子的克隆，送由上海鼎安生物科技有限公司测序。测序获得的序列去除T-DNA载体序列后，将剩余的序列与GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、稻瘟菌基因组数据库（http：//www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/index.html）进行Blast比较分析及相关生物信息学分析，以推断T-DNA所插入的基因及其可能的功能。此外，应用SignalP 3.0 server（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）推断所获得的基因序列中是否含有信号肽（signal peptide，SNP）；应用Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）推测基因编码的蛋白可能的结构域；应用TMHMM-v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测基因编码的蛋白可能的跨膜结构域；应用Protcomp-v 6.0（http：//sun1.softberry.com/berry.phtml）对基因编码的蛋白质进行亚细胞定位，该软件可将蛋白质按细胞核、质膜、胞外分泌、细胞质、线粒体、内质网等归属进行划分；应用TargetP-v 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进一步确定预测蛋白的亚细胞定位，其可将蛋白质的定位归属于线粒体、叶绿体、胞外分泌以及其他亚细胞定位。将随机选取的60个突变体与野生型菌株FJ95054B分别接种在国际水稻研究所提供的CO39近等基因系的6个水稻品种上，即C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b、CO39，每个突变体都进行3个平行以上的接种试验。接种后发病情况显示：野生型菌株FJ95054B对Pi-1（t）、Pi-2（t）、Pi-4a均无致病性，对Pi-3（t）、Pi-4b、CO39致病，而在随机选取的突变体中有3个突变体的致病性发生了稳定的变异，如表1、图1所示。其中，突变体2t-2 T940024501对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，突变体T940084501和T940086501在水稻品种CO39上的致病性减弱。菌株号IsolatesC101LACPi-1（t）C101A51Pi-2（t）C104PKTPi-3（t）C101PKTPi-4aC101TTP-4L-23Pi-4bCO39FJ95054B（WT）RRSRRS2t-2T940024501/++////T940084501/////—T940086501/////—表1 稻瘟病菌T-DNA插入致病性突变体接种CO39近等基因系的发病情况*Table 1 Virulence of T-DNA insertional pathogenicity mutants on CO39 NILs稻瘟病菌侵染过程中的任何一个环节被破坏均会导致致病性减弱或丧失，因此，对致病性减弱的突变体进行相关表型分析，有助于了解其致病性减弱的原因。筛选出的两个致病性减弱突变体的生长发育变化情况如表2所示。与野生型FJ95054 B相比，两个突变体均表现出生长速度减缓、单位面积产孢量显著减少、孢子萌发率和附着胞形成率降低的性状（在α=0.05水平上差异显著）， 这些都可能是造成突变体致病性减弱的原因。图1 稻瘟病菌致病性突变体的变化情况Figure 1 Pathogenicity of mutants of M.grisea compared with wildtype FJ95054B菌株Isolate菌落直径Colonydiameter（cm）产孢量Sporulation（105spores/cm2）8h孢子萌发率Percentageofsporegermination8hpi（%）16h附着孢形成率Percentageofappressoriumformation16hpi（%）95054B（WT）5.20±0.100.7499.0693.68T-9400845014.17±0.030.001287.9073.17T-9400865014.22±0.070.003383.8963.69表2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的生长发育变化Table 2 Morphology and development of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea此外，在洋葱表皮侵入实验中，野生型FJ95054B侵入正常，能形成正常的附着胞以及侵染栓，并能观察到菌丝在洋葱细胞内广泛蔓延。相比之下，突变体T940084501的孢子能够形成附着胞，但随后并未形成侵染栓侵入，未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延；而突变体T940086501的部分孢子能够形成附着胞，但同样未能形成侵染栓侵入，也未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延，还有部分孢子甚至不会形成附着胞。这些都可能是其致病性减弱的原因。实验结果如图2所示。图2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的洋葱表皮侵入实验结果Figure 2 The results of onion penetration assays of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea使用右边界嵌套特异引物RB与随机简并引物AD7组合，扩增出了突变体2t-2 T940024501的T-DNA侧翼序列（如图3A所示）；使用左边界嵌套特异引物LB与随机简并引物AD9组合，扩增出了突变体T940084501的T-DNA侧翼序列（如图3B所示）。突变体T940086501的T-DNA侧翼序列通过TAIL-PCR反应尚未获得。通过在稻瘟菌基因组数据库进行的比对分析，结果显示突变体2t-2 T940024501 T-DNA侧翼序列中的117～591 bp区段与稻瘟病菌基因组supercontig5.183的776534～777008 bp同源（同源率98%）， T-DNA 插入位点位于基因 MGG_07927.5 的外显子区，该基因位于Chromosome/Linkage GroupⅢ，编码一个假定蛋白（ hypothetical protein）， 该蛋白属于Glyco-syl hydrolases family 18（糖基水解酶家族18）。图3 TAIL-PCR第二步和第三步产物的电泳图谱Figure 3 Electrophoresis patterns of secondary and tertiary TAIL-PCR products（secondary and tertiary products of the same isolate are loaded side by side）分别利用SignalP 3.0、Protcomp-v 6.0、TMHMM-v 2.0、TargetP-v 1.1以及Pfam对该基因编码的蛋白进行分析。首先通过Signal IP 3.0预测，并不包含信号肽结构；继而经TMHMM-v 2.0预测，不含跨膜结构；通过Protcomp-v 6.0和TargetP-v 1.1分析表明，含有胞外分泌信号，是一种胞外分泌蛋白，在胞内无定位。另外，Pfam分析结果表明，该基因可能具有某种糖基水解酶活性。目前仅知该基因被T-DNA阻断后，突变体菌株对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，至于其在病原菌致病过程中的具体功能尚需通过进一步的基因敲除和功能互补实验加以确定。至于突变体T940084501的T-DNA侧翼序列，在稻瘟病菌基因组数据库中未比对到其同源序列，而在GenBank数据库中同样未比对到与稻瘟病菌相关的同源序列。由于该序列可能是FJ95054B菌株的特异序列，拟根据该序列扣除与载体有关序列及引物序列后的剩余序列设计引物，筛选FJ95054B BAC文库。对稻瘟病菌无毒基因以及致病过程有关基因的研究一直是了解稻瘟病菌致病性及其变异机制乃至水稻与稻瘟病菌特异性互作机制的关键所在，而研究某一个具体基因的功能最便捷的方法就是对该基因的突变体进行分析，这也正是本研究筛选T-DNA插入所致致病性突变体的初衷所在。获得致病性变异稳定的突变体是本研究的关键之一。本研究通过大量平行、重复实验初步筛选出致病性表型稳定的突变体，随后为避免由于菌株污染而造成的致病性变异的假象，还进一步将所获得的致病性突变体进行单孢分离，将分离的单孢与原菌株一同进行接种实验，结果显示单孢与原菌株的发病情况基本保持一致。这为进一步的分子水平的研究奠定了良好的基础。本研究对所获得的基因的功能还只是做了初步的预测，为了明确其功能尚需要借助进一步的基因敲除和功能互补实验。另外，为了明确致病性变异是否为单基因作用所致，尚且需要对致病性突变体的后代群体进行接种实验和潮霉素抗性分析，通过检测其后代的表型分离比率加以验证。

利用4个抗感杂交组合 （‘富士’ב金冠’ ‘金冠’ב富士’‘嘎拉’ב富士’ ‘富士’בQF-2’） 进行了苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析。结果表明，4 个群体中抗、感植株的分离比分别符合1∶1、1∶1、0∶1和1∶0的理论比值，初步推测苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为 rr，感病基因型为 RR和Rr。由此推测供试杂交群体的亲本品种 （系） ‘富士’ ‘金冠’‘嘎拉’ ‘QF-2’ 的基因型分别为rr、Rr、RR和rr。利用207株 ‘金冠’ב富士’ 的杂交后代为试材，构建了抗感基因池用于BSA分析。从HiDRAS和GenBank网站上下载了300 对均匀覆盖苹果染色体组的 SSR 引物，通过在亲本及抗感池中的初步筛选，将产生多态性条带的引物进行群体验证，获得了两个位于苹果15号连锁群上与抗病性状相关的分子标记 CH01d08 和 CH05g05。通过MapMarker 4.0 软件分析，将这两个标记定位于Rgls基因两侧，重组率分别为7.3%和 23.2%。依据苹果基因组 CH01d08 和 CH05g05 标记之间的序列，自行设计了276对SSR引物。经过亲本及抗感池的初步筛选及群体验证，最终筛选出 9 对与 R gls基因位点连锁的分子标记。将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合采用 JoinMap ver.4.0软件，完成了SSR标记与Rgls基因位点的连锁图谱。这11个标记覆盖了49.2 cM的遗传距离，最近的标记为 S0405127 遗传距离为 0.5 cM。Rgls基因位点两侧最近的两个标记 S0304673 和 S0405127 之间的物理距离为500kb。以‘金冠’和‘富士’及‘金冠’ב富士’的F1代群体中20株极端抗和20株极端感炭疽菌叶枯病的单株为材料，利用全基因组重测序（whole genome re-sequencing，WGR）技术，结合混合分组分析法（bulked szegregate analysis，BSA）共开发SNP位点3399950个，InDel位点573040个，SNP位点位于内含子上的465317个，位于外显子上的13029个，其中同义变异7330个，InDel位点位于内含子上的108996个，位于外显子上的19957个，其中插入或缺失3或3的整数倍的碱基，不改变蛋白质的编码框的有6928个。在全基因组范围内共得到33个候选的SNP位点及所对应的29个候选基因。通过对△（SNP-index）的筛选，将抗性基因位点快速定位于苹果第15条染色体的2～5Mb的区域内，结合SSR标记定位结果，最终锁定18个SNP位点、30个InDel位点，以及5个候选基因。通过对5个候选基因在接种病原菌后不同时间点的表达量差异及生物信息学分析，结果显示，基因MDP0000686092、MDP0000205432、MDP0000120033为功能未知蛋白，基因MDP0000945764具有CCHC型锌指结构，是丝氨酸/精氨酸富集剪接因子，具有核酸绑定、锌离子结合分子功能，参与RNA剪切生物过程，调节基因产物的表达。基因MDP0000864010具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）NAD（P）绑定区域，属于NAD依赖差向异构酶/脱氢酶家族，具有辅酶绑定功能，可能与鼠李糖生物合成酶1有关。通过qRT-PCR验证，5个候选基因均不同程度的响应炭疽叶枯病病原菌的诱导，是苹果炭疽叶枯病抗病相关基因。通过高分辨熔解曲线 （HRM） 分析技术对SNP 及InDel标记进行验证。对SNP 及InDel引物在亲本和抗感基因池中进行初步筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，获得了6个SNP 及5 个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。从中挑选了10 个标记对所检验出的重组个体进行了分析，将 Rgls基因位点定位于标记 InDel4199 和SNP4257之间，范围缩小为58 kb以内。以青岛农业大学苹果试验基地 （山东省胶州市） 栽培的50 个田间栽培品种和品系为试材，利用四个紧密连锁的分子标记 S0405127、S0304673、SNP4236和InDel4254验证了分子标记的可靠性。结果表明，SSR标记 S0405127，S0304673，SNP 标记 SNP4236，InDel标记InDel4254鉴定的准确率分别为 90.0%，94.0%，98.0%，96.0%，其鉴定结果的准确率均达到90%以上，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。一是通过对4个杂交组合的F1 群体及4个亲本进行苹果炭疽菌叶枯病抗性鉴定和遗传分析，推断出苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR和Rr。二是通过300对均匀覆盖苹果染色体组的SSR引物和自行设计的276对SSR引物在亲本及抗感池中进行筛选，得到的多态性标记经作图群体验证，共获得了11个与Rgls基因位点连锁的分子标记，将抗病基因定位于苹果第15条染色体上，并完成了SSR标记与Rgls基因位点连锁图谱的构建。将 Rgls基因位点定位在 SSR 标记 S0304673 和S0405127之间，物理距离为500 kb，与最近的标记 S0405127 的遗传距离仅为0.5 cM。三是开发了与抗炭疽菌基因相关的 SNP 标记和 Indel标记，并对部分SNP 及 InDel 标记进行了验证，将 R gls基因位点进行精细定位，将抗病基因的范围进一步缩小至58 kb，并获得了14 个与抗病相关的候选基因。

苹果 （ Malus pumila Mill.） 是世界上栽培最为普遍的落叶果树之一，有着很强的生态适应性，地域分布极为广泛。中国不仅是苹果属植物的发源地之一，拥有悠久栽培历史和极为丰富的苹果种质资源，也是世界上最大的苹果生产国和消费国，在世界苹果产业中占有重要的地位。近年来，我国苹果栽培面积快速增长，苹果产量和质量得到了稳步提髙。据统计数据显示，2015年我国苹果栽培面积和产量分别达到232 万 hm2和 4300万 t，居世界首位。苹果在调整农业产业结构、增加农民收入、促进地方经济快速发展等方面发挥着越来越重要的作用。病害是制约着苹果产业发展的重要影响因素。其中苹果炭疽病是苹果生产中普遍发生的一种重要病害，包括发生在果实上的苦腐病（Bitter rot of apple） 和主要发生在叶片上的炭疽菌叶枯病 （ Glomerella leaf spot，GLS）。苦腐病又被称作晚腐病，是苹果果实的三大病害之一，多在果实成熟期或半成熟期发病，主要是引起大量落果、果实腐烂，降低了果实的产量和商品价值。而苹果炭疽菌叶枯病是一种流行性很强的病害，由于该病潜育期短、发病快，在外界环境条件适宜的情况下从侵染到发病落叶仅需要3d或者更短的时间，造成树叶大量干枯、脱落，严重时形成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点，不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重地威胁着苹果产业的发展。特别是广泛种植于我国各大苹果产区的重要栽培品种 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 品种极易感病，尤其是 ‘金冠’ 在世界苹果生产国中 （中国除外） 品种比例最高，这也是选择 ‘金冠’作为苹果基因组测序材料的重要原因。它不仅是生产上的优良品种，同时也是苹果育种的核心亲本 （陈学森，2015），所以炭疽菌叶枯病的侵染不仅仅是对 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 等品种的侵害，而可能是对 ‘金冠’ 系、‘嘎拉’ 系苹果的为害。化学药物防治是目前采用的主要防治方法，但成效甚微。所以急需培育出抗病品种从根本上解决该问题，同时也减少了果园化学试剂的使用，降低农药残留，保证果品的安全。但育种实践表明，要实现育种目标，在亲本选择与选配恰当的前提条件下，必须保证每个杂交组合有足够数量的后代群体，至少 3000株 （陈学森，2010），加上果树具有童期长 （6～12 年），基因组高度杂合，杂种后代广泛分离，自交不亲和，许多重要的经济性状是多基因控制的数量性状等特点，使得常规育种工作难度大、周期长。因此利用杂交后代早期选择技术，及早地剔除非目标基因的单株，减少杂种后代的数目，提高筛选效率，减少盲目性是提高育种效率的最实用有效的方法。随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。同时，通过构建高密度分子标记遗传图谱对重要农艺性状基因进行标记定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并验证其功能，阐明其作用机制，通过基因工程实现对果树性状的改良。因此，揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，构建精细的抗病遗传图谱对于定位抗病基因，研究基因功能，探索、掌握抗病机制，培育抗病品种有着重要的意义。苹果炭疽菌叶枯病 （ Glomerella Leaf Spot，GLS） 是近几年在中国大部分苹果主产区新出现的一种流行性很强的真菌病害。主要为害苹果叶片，造成病叶早期的干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点，导致苹果失去商品价值 （刘源霞等，2015）。该病于1988年首次报道于巴西，导致感病的 ‘嘎拉’ 苹果70%以上的叶片脱落，经鉴定其病原为围小丛壳Glomerella cingulate （Leite et al.，1988；Camilo＆Denar-di，2002；González et al.，1999，2003），为盘长孢状刺盘孢 Colleto-trichum gloeosporioides 的有性态，定名为围小丛壳叶斑病 （ Glomerella leaf spot，GLS），在中国被称为炭疽菌叶枯病。1997—1999年在巴西6个苹果产区均发现了炭疽菌叶枯病，由于‘嘎拉’ 品种是巴西的主栽品种，所以该病严重威胁着巴西苹果产业，成为巴西苹果的主要病害 （Katsurayama et al.，2000；Crusius et al.，2002；Velho et al.，2014）。1998 年在美国田纳西州的两个 ‘嘎拉’果园中暴发了苹果炭疽菌叶枯病，引起大量落叶，这也是美国首次报道苹果炭疽菌叶枯病的发生，随后在佐治亚州和北卡罗来纳州也发现了这种病害 （González，1999，2003）。我国最早于2008 年发现了炭疽菌叶枯病 （王素芳，2009），2010年相继报道了在黄河故道苹果主产区发现了炭疽叶枯病，该病引起 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果的大量落叶。尤为严重的是在 2011 年，据报道江苏丰县、安徽砀山、淮北等地栽培的 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果品种大面积发生叶斑病，导致叶片干枯脱落，严重的造成果树二次开花 （宋清等，2012） （附图1-1）。经鉴定该病为苹果炭疽菌叶枯病，病原为围小丛壳 G. cingulata （宋清等，2012；Wang et al.，2012）。González 等 （2006）通过利用mtDNA-RFLP 对病原菌的甘油酸脱氢酶核苷酸序列进行分析，认为引起 GLS 的病原分别属于尖孢炭疽菌 C. acutatum 和围小丛壳G. cingulata。这两种菌分别归属于尖胞刺盘孢复合群和盘长孢状刺盘孢复合群 （王嶶等，2015）。王薇等 （2015） 的研究明确了在我国引起该病害的病原为果生刺盘孢 （ Colletotrichum fructicola） 和隐秘刺盘孢 （ C. aenigma），均归属于盘长孢状刺盘孢复合群。中国是否存在尖孢刺盘孢复合群的病原，还没有明确的结论。由苹果叶枯炭疽菌引起的苹果炭疽菌叶枯病症状为 （附图1-2）：在幼叶上发病时，初期表现为红至黄褐色或红褐色小点，针尖大小，边缘不规则，病健交界不清晰。在老叶上发病时，初期表现为黑色坏死性病斑，病斑边缘模糊。在7—8月高温高湿或连续阴雨的条件下，病斑迅速扩展，2～3d便可使整个叶片失水、焦枯、变黑、坏死，很快脱落。感病叶片在环境条件不适宜时，病斑停止扩展，在叶片上形成大小不等的枯死斑，病斑周围的健康组织逐渐变黄，叶片呈现花叶状，病重叶片逐渐脱落。病斑的形状多为圆形或椭圆形，也可能形成不规则的形状。病原菌侵染果实时，前期为红褐色小点，然后变为圆形或近圆形红褐色斑点，病斑周围有红褐色晕圈，中间变为灰白色，微凹。在自然环境条件下果实病斑上很少产生分生孢子，与常见的苹果炭疽病的症状明显不同。叶片上的病斑多为直径在 1～2 mm的小斑点，也有少数病斑直径超过1 cm。后期病斑中央产生黑色小点 （分生孢子盘），呈轮纹状排列，病斑上形成大量淡黄色分生孢子堆，当孢子萌发时会在病斑上产生白色丝状物 （宋清等，2012；符丹丹，2014）。苹果炭疽菌叶枯病的病原菌有性世代为 Glomerella cingulata （Stonem） Spauld＆Schrenk，属真菌子囊菌 （亚） 门，球壳目，小丛壳属，围小丛壳菌；无性世代为胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Penz.＆Sacc.和尖孢炭疽菌C. acutatum J.H.Simmonds （González，2003）。在PDA 平板上培养的菌落特征为（附图1-2e）：菌落边缘完整，呈规则圆形，气生菌丝呈絮状，比较稀疏，边缘颜色为白色中间为淡灰色。分生孢子堆呈柠檬色或橙色（符丹丹，2014）。在一般情况下，苹果炭疽叶枯病病原菌主要在苹果的休眠芽和枝条上越冬，也可以以菌丝体的形态在病僵果、干枝、果台和有虫害的树枝上越冬。5月在条件适宜的情况下产生分生孢子，成为初侵染源，越冬的子囊壳也是初侵染源之一 （宋清等，2012）。病原孢子可以随着雨水或气流传播，经皮孔或伤口侵染后，进入苹果叶片或果实内。病害发生时，首先形成中心病株，随后迅速的向四周蔓延侵染，可多次侵染，最终造成病害大面积的发生。Wang等 （2015） 的试验结果表明，温度和湿度是炭疽菌叶枯病发生的必要条件。苹果炭疽菌叶枯病病原菌分生孢子萌发的温度范围在15～35℃，最适宜温度为30℃。菌丝生长的温度范围在15～35℃，最适宜温度为25℃。炭疽菌叶枯病病原菌主要依靠雨水传播，病原菌分生孢子的萌发和侵染也需要自由水或高湿环境，而我国北方苹果主产区6—8月气温多在30℃左右，雨水充沛，满足了苹果炭疽菌叶枯病病原菌的传播、侵染和发病条件，是苹果炭疽菌叶枯病病害发生的高峰期。植物虽然在充满多种潜在病原微生物的环境中生长，但是在多数情况下植物并不表现出感病，这表明，植物在与病原微生物共同进化过程中，为了防御病原微生物的入侵，逐渐形成一套天然的免疫系统（Takken et al.，2009；Boller et al.，2009）。研究表明，病原微生物表面存在着一些保守分子，而且很少发生变异，对维持微生物的基本生物学特征非常重要。这些保守的分子特征被称为病原相关分子模式 （Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs） （Jones and Dangl，2006），例如细菌的鞭毛蛋白 （flagellin）。这些保守的分子并非病原微生物所特有，而是广泛的存在于微生物中（Zipfel et al.，2008），所以它们也被称之为微生物相关分子模式（Microbe-associated Molecular Pattern，MAMPs）。真菌的病原相关分子模式主要包括多聚半乳糖醛酸内切酶、麦角甾醇、木聚糖酶以及细胞壁衍生物葡聚糖和几丁质等；细菌的病原相关分子模式主要包括冷激蛋白、脂多糖、延伸因子 （EF-Tu） 及鞭毛蛋白等，卵菌的病原相关分子模式主要包括 β-葡聚糖及转谷氨酰胺酶等 （Van et al.，2008；Naito et al.，2008）。与之相对应，植物的细胞表面存在着识别病原相关分子模式的模式识别受体 （Pattern Recognition Receptors，PRRs）。P RRs是一类跨膜蛋白，具有高度的灵敏性和专化性，大都是存在于细胞表面的受体激酶或者具有亮氨酸重复序列的受体样蛋白 （LRR-RLP） （Fritz-Laylin et al.，2005）。例如，鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Gomez-Gomez，et al.，2000；Chinchilla，et al.，2006）、水稻几丁质酶的识别受体CEBiP （Kaku et al.，2006）、延伸因子的识别受体EFR （EF-Tu receptor） （Zipfel et al.，2006）、水稻 Ax21 的识别受体 XA21 （Park et al.，2010）、拟南芥几丁质酶的识别受体CERKl （Miya et al.，2007；Wan et al.，2008）、水稻几丁质酶的识别受体OsCERK1 （Chen et al.，2010）等。在病原微生物与植物表面接触的瞬间，植物通过其细胞表面的PRRs感知病原微生物的 PAMPs，从而识别各类微生物，激活一系列的信号元件，启动植物的先天免疫反应 （Zhang，2010）。这种通过植物的PRRs感知 PAMPs并启动的主动防卫反应被定义为植物的基础抗性 （Basal Disease Resistance），也称为基础免疫 （Basal Immunity） （Boller et al.，2009）。该免疫过程被称为病原物相关分子模式触发免疫 （PAMP-triggered Immunity，PTI），可以激活植物体内的一系列抗病反应，包括激酶的活化、胼胝质沉积、PR-蛋白的表达以及miRNA 的合成等 （Navarro et al.，2008），从而帮助植物阻止了环境中绝大多数病原微生物的入侵 （赵开军等，2011；柏素花，2012；程曦等，2012）。在PTI中，研究最为清楚的 PAMPs 及其相应 PRR 是细菌的鞭毛蛋白以及拟南芥中鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Flagellin-sensing 2）。鞭毛蛋白是一种构成细菌鞭毛的粒状蛋白。在对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 的序列分析中发现，其鞭毛蛋白 N 端存在着一个肽段 （flg22），含有22个氨基酸，具有激发子活性。该区域在革兰氏阴性菌中高度保守 （Felix et al.，1999）。Chinchilla等 （2006）发现在模式植物拟南芥中，鞭毛蛋白的识别受体是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶 （Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK） FLS2。LRR-RLK是一类单跨膜蛋白，通常由富含亮氨酸重复序列的膜外功能区，跨膜区以及胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区组成。FLS2能特异性识别并结合 flg22。现已证明番茄、烟草以及水稻中的FLS2 同源蛋白均对鞭毛蛋白具有识别功能 （程曦等，2012）。水稻白叶枯病菌 （ Xanthomonas oryzae pv.Oryzae） 的病原相关分子模式（PAMP） 是N末端具有一个硫酸化肽段 （axYS22） 的蛋白 Ax21，由17个氨基酸组成。 axYS22 结构在所有黄单胞菌属细菌中高度保守。而在水稻中能够结合并识别 axYS22的模式识别受体是LRRXII 亚家族的类受体激酶XA21 蛋白 （Lee et al.，2009）。几丁质是大多数高等真菌细胞壁的主要组成成份。源于几丁质的 N-乙酰几丁寡糖是许多植物的PAMP。水稻几丁质结合蛋白 （Chitin elicitor binding protein，CE-BiP） 和拟南芥的受体激酶 （LysM-containing chitin elicitor receptor ki-nase，CERKl） 是典型的真菌病原识别受体。水稻的几丁质结合蛋白是一类跨膜蛋白，带有两个胞外 LysM 基序，能够与几丁质结合，但缺少胞内蛋白激酶区域。这很可能暗示着CEBiP 介导的免疫反应需要其他受体的参与 （Kaku et al.，2006）。拟南芥的受体激酶含有三个胞外LysM基序和一个胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，它能够在体外直接结合几丁质 （Lizasa et al.，2010）。植物通过PRRs识别外来病原微生物的 PAMPs触发 PTI，成功抵挡了大部分病原微生物的侵入，保护宿主免受侵染。然而有少数病原微生物依然能够通过效应子抑制 PTI，从而成功避开宿主的防御，进而展开进一步入侵。效应子对P TI的抑制方式是多样的，一部分效应子可能促进病原物扩散或植物细胞养分渗漏 （Badel et al.，2002），一部分效应子有可能在卵菌及真菌侵染植物细胞并形成吸器外基质的过程中起到了框架结构作用 （Schulze-Lefert et al.，2003），一部分效应子则有可能对P TI过程中的一个或多个成分起到了抑制作用。在植物的许多致病细菌中都具有III型分泌系统 （Type III secretion system，TTSS）。该系统能够使致病细菌直接将效应子送入宿主植物细胞中。细菌效应子常常通过模仿或抑制真核生物的细胞功能来实现病原菌对宿主的侵染。在拟南芥及烟草中，丁香假单胞菌株 DC3000 所分泌的效应子AvrPto以及 AvrPtoB 能够成功的抑制 PTI的防卫反应并促进细菌繁殖。对这两种蛋白结构的分析表明， AvrPto可能作为一种蛋白激酶抑制剂，与FLS2、 BAK1及EFR的激酶区域相互作用，抑制了 PRRs的激酶活性 （Xiang et al.，2008），并干扰了 FLS2-BAK1 复合体的形成 （Shan et al.，2008）。 AvrPtoB是一种类泛素连接酶蛋白，其酶活性与 FLS2 的泛素化及降解有关 （Gohre et al.，2008）。丁香假单胞菌的另一个效应子 HopAI1 是一个磷酸苏氨酸裂解酶，能够使丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs） MPK3和MPK6去磷酸化，从而实现了对PRR信号的传导终止，抑制了宿主PTI的功能 （Zhang et al.，2007）。病原微生物能够通过效应子的作用抑制宿主的 P TI防卫反应，从而成功的进入宿主体内。病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的。然而在自然选择压力下，植物也相应的进化出能够特异性的识别这些效应子的受体，在植物细胞内部开启了由效应子触发的免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI） （Takken and Tameling，2009）。该免疫主要依靠抗病基因 （Resistance gene，R gene） 所编码的NB-LRR （Nucleotide binding-leucine rich repeat） 蛋白产物起作用，它们能够识别病原菌效应子，激活并介导小种专化抗性。这种抗性通常伴随有局部细胞死亡即超敏反应 （hypersensitive response，HR）。植物 NB-LRR 蛋白是植物细胞内的一类能与核苷酸结合并具有亮氨酸重复序列的蛋白质，是由一个多变的N 末端，C末端的LRR区域及一个NB-ARC结构域构成 （Elmore et al.，2011）。植物识别效应子并导致NB-LRR蛋白构象发生改变，从而将 NB-LRR 蛋白由抑制状态转变为激活状态，进一步诱导下游信号的转导 （Collier et al.，2009），从而实现对病原菌的防御反应。NB-LRR 蛋白对效应子的识别一般采用两种方式：间接识别和直接识别。间接识别大都是由病原效应子诱导特定的宿主蛋白发生修饰，修饰的宿主蛋白再激活 NB-LRR蛋白，完成抗病反应。拟南芥中的 RIN4 蛋白就是一种能够被病原效应子特定诱导的宿主蛋白。该蛋白是多种病原效应子 （ AvrRpt2、AvrRpm1、 AvrB 及 HopF2） 的靶标，在病原效应子的诱导作用下，RIN4蛋白被修饰，从而激活NB-LRR 蛋白，触发下游免疫应答。 Avr-Rpt2对RIN4的修饰作用是通过对RIN4蛋白的直接裂解完成的，从而激活NB-LRR蛋白RPS2介导的 ETI （Axtell et al.，2003）。直接识别是NB-LRR 蛋白与病原菌的效应子直接结合。例如，拟南芥中的RRS1-R 蛋白能够与茄科雷尔氏菌 （ Ralstoniasolanacearum） 的效应子Pop2 直接结合，从而启动了ETI应答 （Deslandes et al.，2003）。通过酵母双杂交实验也证明了亚麻的 TIR-NB-LRR 蛋白能够与亚麻锈病病菌的效应子Avr567相互作用，开启ETI应答 （Dodds et al.，2006）。植物与病原微生物之间相互作用并协同进化的过程被 Jones 等（2006） 总结为 “之” 字形模型 （附图1-3）：这个过程可以分为四个阶段，第一阶段：触发 P TI。植物通过 P RRs识别绝大多数病原微生物的 PAMPs，从而引发基础抗性。第二阶段：抑制 PTI。病原微生物相应的进化出效应子来抑制 PTI，避开宿主的防御，对植物展开再次侵染，此时植物对病原微生物是感病的。第三阶段：触发 ETI。在自然选择压力下，植物进化出能够特异性识别相应效应子的 NB-LRR蛋白，激发防御反应，阻止病原微生物的进一步侵染。第四阶段：避开 ETI。病原微生物通过不同的进化策略，产生新的效应子，展开新一轮的入侵。长期以来，作物的抗病育种主要使用了小种专化性抗病性 （即过敏性坏死反应类型），由于病原微生物生理小种的变异，导致作物抗病性的 “丧失”，缩短了抗病品种的使用年限。而且随着作物产量水平的不断提高，农田生态条件的变化和作物抗性资源的消耗，许多新的病害逐渐显现。再加上抗病性多与不良农艺性状相连锁，所以要培育出优良的抗病品种越来越难。抗病分子机理的研究为作物抗病育种提供了新的发展思路。一是重视 P TI的利用。植物细胞表面的模式识别受体对病原微生物相关分子模式的识别，诱导 P TI，是植物免受病害侵染的第一道防线。因此将 P TI 有效应用于作物抗病品种的选育，有望获得广谱性抗病品种。拟南芥中的受体基因 EFR 能够识别细菌延伸因子EF-Tu。Lacombe等 （2010） 利用农杆菌介导法将拟南芥中的受体基因 EFR 转入到烟草和番茄的基因组中，成功获得了转基因植株。经验证，转入 EFR 基因的植株可以抗假单胞菌属 （ Pseudomonas）、黄单胞菌属 （ Xanthomonas）、拉尔氏菌属 （ Ralstonia） 和农杆菌属（ Agrobacterium） 等不同属的病原细菌。这说明在育种中可以充分利用不同植物的模式识别受体基因来培育出具有广谱性、持久性抗性的作物新品种。二是将 ETI 与 PTI 相结合。植物大多数 R-基因是专门为识别病原微生物效应子而进化的，而病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的，所以尽管植物ETI 能很强的特异性抵抗某种病害，但是也容易激发病原微生物产生新的效应子而避开原有的 ETI，使抗性消失。如果在利用 ETI 时，结合利用 PTI，便可以达到两道防线共同作用的效果，可以有效地避免大面积推广的抗病品种因 ETI的丧失而造成重大的产量损失。在育种实践中，利用P TI 抗性较好的栽培品种作为育种材料，利用多基因聚合或多基因转化将多个优良抗病基因导入其中，有利于扩大作物的抗病广谱性，改良作物的 ETI 抗性。近等基因系法 （Near-isogenic Lines，NIL） 和分离群体分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA） 是获取与抗病基因紧密连锁的分子标记的两种最经典的方法。近等基因系是指仅在目标性状存在差异的两种基因型个体，通过杂交及多代自交或回交分离而获得的群体 （Young，1998）。近等基因系法的基本原理是比较轮回亲本与近等基因系及供体亲本三者的标记基因型。当近等基因系与供体亲本具有相同的标记基因型，但与轮回亲本的不同时，则该标记就有可能与目标基因连锁 （Muehlbauer，1988）。近等基因系的建立一般需要连续自交或回交6～8 代，耗时较长，而且常会导致一些重要基因的丢失或形成连锁累赘，因而限制了它的应用。分离群体分组分析法又称近等基因池法，是从近等基因系法演化而来的，属于双尾分析中的选择 DNA 基因池法 （selective DNA pooling，SDP）。Michelmore等 （1991） 首先利用 BSA 法在没有近等基因系的条件下通过对F2分离群体进行RAPD分析，成功的从100 个引物中筛选出3 个与莴苣霜霉病抗性基因 Dm5/8紧密连锁的 RAPD 标记。该实验的基本原理是：具有相对性状 （如抗病、感病） 的一对亲本杂交，在其后代分离群体中，根据个体表型或基因型分为两组 （如抗病组、感病组），选取两组中相同数量的极端差异个体，提取DNA，并进行等量混合，构建两个相当于近等基因系的基因池 （如抗病基因池、感病基因池），并对两个基因池进行标记的多态性筛选。由于两个基因池在遗传背景上是相似的，表型上的差异就有可能是由于某一目的基因的改变而造成的。因此两池间筛选出的多态性 DNA 标记就有可能是与目的基因连锁的分子标记。将多态性分子标记在后代分离群体上进行进一步验证，就可以分析出多态性标记与目的基因是否连锁以及连锁程度 （廖毅等，2009）。分离群体分组分析法包括基于标记基因型的 BSA 法 （Giovannoni et al.，1991） 和基于性状表现型的 BSA 法 （Michelmore et al.，1991）。前者是根据已有图谱或标记信息对基因进行精细定位，后者是通过对分离群体中就某一性状表现极端差异的个体进行分组，构建两个相对性状的 DNA 池，并筛选与目的基因连锁的多态性标记，实现对基因的初步定位。BSA 法具有许多优点：如原理简单、操作方便、实用经济等，重要一点是克服了许多作物没有或者难以创建近等基因系的限制，所以被广泛应用于质量性状单基因的定位以及数量性状主效基因的定位。2007 年，Korol等对 BSA法进行了优化，在精密仪器的辅助作用下实现了对定位效应较大QTL的定位。许多学者从理论上和实践上都证明了 BSA 法对数量性状基因定位的合理性 （Wang and Paterson，1994；William et al.，1997；Chagué et al.，1997；Hill，1998；Mackay and Caligari，2000；Chantret et al.，2000）。分子标记 （Molecular markers） 是 20 世纪 80 年代以来，继形态标记 （Morphological marker）、细胞标记 （Cytological marker）、生化标记 （Biochemical marker） 三大遗传标记之后，又诞生的一种以 DNA一级序列的多态性为基础的新的遗传标记。分子标记与其他遗传标记的不同之处在于，分子标记能够直接从 DNA 序列上找出差异。因此其具有如下的优点：一是准确性高，不受组织器官、个体发育时期状况、环境条件等因素的干扰；二是检测定位多，几乎遍及整个基因组；三是共显性好，有些共显性分子标记可有效的鉴别出二倍体中纯合和杂合基因型；四是多态性高，无需专门去创造特殊的遗传材料，自然就存在着许多等位变异；五是表现为 “中性” （即无基因多效性），与不良性状没有必然的连锁遗传，也不影响目标性状的正常表达；六是遗传稳定，可靠性强，检测速度快，操作简单。根据分子标记的发展进程，可以将其归类划分为三代分子标记：第一代分子标记以扩增片段长度多态性分子标记 AFLP （Amplified fragment length polymorphism）、限制性片段长度多态性分子标记 RFLP （Restriction fragment length polymorphisms）、随机扩增多态性DNA分子标记 RAPD （Random amplified polymorphism DNA） 为代表。第二代分子标记以重复序列的重复次数作为标记，操作较为简单，易于分型，且为共显性标记，更便于进行遗传分析。其代表性标记为简单重复序列标记 SSR （Simple sequence repeat） 和简单重复序列间扩增标记ISSR （Inter-simple sequence repeat）。第三代分子标记以核苷酸多态性标记SNP （Single nucleotide polymorphism）、插入缺失标记 InDel （In-sertion-deletion）、拷贝数变异标记 CNV （Copy Number Variation） 为代表，在后基因组时代已被大量开发，并被广泛使用。这类标记的最大特点是数量多、范围广、为显性标记、易于高通量分型。SSR （Simple sequence repeat），即简单重复序列，又称微卫星（Microsatellite），是Litt等1989 年提出，Moore等1991 年创立的。由1～6 个核苷酸为单位组成的串联重复序列 （Wang，1994），是 DNA复制和修复过程中，微卫星序列内发生滑链错配或不均等重组时，导致增加或缺失一个或更多的重复单元 （Levinson and Gutman，1987；Richards，1992），广泛分布于植物和动物的基因组中 （Tautz and Renz，1984）。每个SSR两侧具有相对保守的单拷贝序列，这为设计特异引物扩增SSR序列提供了模板。由于扩增产物中基本单元重复次数的不同，就形成了SSR座位的多态性。通常经过SSR引物扩增出来的PCR产物，可以经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳进行检测其多态性。SSR分子标记的优点在于信息量大、多态性高、重复性好、操作简单、呈共显性 （Kalia et al.，2011），因此被广泛应用于作物及果树等目标基因的遗传定位、遗传连锁图谱的构建、遗传多样性的检测以及分子标记辅助育种等方面。SSR标记的开发：目前常见的 SSR标记开发的方法包括数据库检索法、构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法以及省略筛库法等。其中数据库检索法是开发SSR标记既经济又有效的方法。充分利用现有的DNA序列数据库中的信息，搜索 SSR 序列，可以轻松的获得全基因组的所有SSR引物，省去构建基因文库、杂交、测序等烦琐的工作，节省了大量的时间和财力。随着高通量测序技术的快速发展，使得如GenBank、EMBL/EBI （European Bioinformatics Institute，http：//www.embl-heidelberg.de/）、NCBI （National Center for Biotechnology Information， http：//www.ncbi.rdm.nih.gov/） 以及 DDBJ （DNA Data Bank of Japan，http：//www.Ddbj.nig.ac.jp） 等公共数据库中各物种的基因组序列、转录组序列及EST序列等不断增多。结合在线软件SSRIT （ http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool） 以及 SSRHunter 等来搜索SSR位点，利用 Primer Premier 5.0 或者利用在线引物设计软件Primer 3.0 （http：//primer3.ut.ee/） 根据位点两侧保守核苷酸序列设计特异性引物。SNP 即单核苷酸多态性，是两个DNA序列中的某个位点由于单个核苷酸的变化而引起的多态性。SNP 标记的优点在于数量多，分布广，相对稳定，易于快速筛查和基因分型。SNP 标记的开发：可以通过多种方式和方法实现对SNP 标记的检测和分析。一是质谱分析法。通过 PCR 扩增后，用质谱进行分析检测。二是HRM分析法。利用高分辨率熔解曲线 （High resolution melt-ing，HRM） 分析方法进行分型检测。三是芯片法。利用 SNP 标记芯片进行分型检测。四是测序法。通过高通量测序手段进行检测 （孙瑞，2015）。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库，具有速度快、高通量的特点。随着测序技术的发展，特别是全基因组测序，不仅可以从全基因组中获得大量的SNP 位点，而且还可以了解到SNP 位点在基因组中的分布状况，对于我们进一步分析基因的功能及表达提供了更多的可能。基于参考基因组序列的分析方法包括：全基因组重测序 （Whole-genome re-sequencing，WGR）、转录组测序（RNA-seq） 和简化基因组测序 （Reduced-Representation Genome Se-quencing，RRGS）。全基因组重测序是对已知物种基因组序列的前提下所进行的全基因组范围内的测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。优点：快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。转录组测序的研究对象为某个体在某一特定的功能状态下所能转录出来的所有 RNA 的总和，检测的是某个体位于编码区的碱基差异。优点是能够降低成本，能够直接检测功能区碱基的序列变化，能够有效的检测分析基因的表达水平，更有可能找到直接与表型相关的 SNP 差异 （Geraldes et al.，2011；Li et al.，2012a）。简化基因组测序是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。RAD-seq （Restriction-site Associated DNA Se-quence） 和 GBS （Genotyping-by Sequencing） 技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，优点是可以大幅度地降低基因组的复杂程度，简化操作，同时不受有无参考基因组的限制，可快速有效地鉴定出高密度的SNP 位点，从而实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。InDel是指父母本之间在全基因组序列范围内存在的差异。一个亲本相对于另一个亲本而言，在基因组中存在着一定数量的核苷酸插入或缺失 （Jander et al.，2002）。InDel标记就是根据基因组中的这些插入或缺失位点，依据一定原则，在其上下游设计一些PCR引物能扩增出包含这些插入缺失位点的碱基片段，成为 InDel标记。基于全基因组重测序的 InDel 标记是遗传标记的一个重要来源，因其具有分布广、密度高、变异稳定、多态性强、基因型判别简单、检测容易等优点，受到越来越多的关注。InDel标记已广泛应用于目标基因的遗传定位、高密度遗传图谱的构建、目的基因的精细定位、生物遗传多样性的分析、种子纯度鉴定及分子标记辅助育种等多方面。Yu等 （2003） 利用InDel标记、RFLP 标记、SSR标记构建了一张向日葵的高饱和度分子标记遗传连锁图谱。Feng等 （2005） 利用日本晴和9311 序列筛选得到的分布于每条染色体的20 对 InDel标记和53 对 SSR 标记，分析鉴定了46份粳稻和47份籼稻的遗传多样性。葛敏等 （2013） 利用生物信息学对玉米全基因组进行扫描，发现可用于开发 Indel分子标记的插入缺失位点，同时成功地运用 Indel分子标记鉴定了玉米杂交种的纯度。Hayashi等将开发的9对InDel标记成功的应用于水稻抗性基因的筛选。分子遗传图谱 （Genetic linkage map） 是不同分子标记在染色体上的位置和相对距离的排列图，遗传图谱上的每个分子标记反映的都是与遗传特征有关的相应染色体座位上的遗传变异和多态性。分子遗传图谱的构建是基于染色体交换与重组的理论，它是分子遗传学研究中的重要领域，是对基因进行定位及克隆的基础，也是遗传育种的重要依据。随着分子标记技术的发展，图谱上标记的种类越来越多，标记的密度也越来越高。起源于 “欧洲苹果基因组作图计划” 的第一张遗传连锁图谱于1994年由 Hemmat等人完成发表。该图谱以56 株 ‘Rome Beauty’בWhite Angel’ 的杂交后代为作图群体，构建了包含 360 个标记的父本和母本两个苹果品种的遗传连锁图 （Hemmat et al.，1994），实现了苹果遗传图谱构建的突破。2003 年，Liebhard 等以 ‘Fiesta’בDiscovery’ 的 267 株 F1 代杂交群体为试材，利用 SCAR、AFLP、SSR、RAPD标记等840个不同类型的分子标记构建了高密度的遗传连锁图谱 （Liebhard et al.，2003）。2009 年，Celton 等利用 93 个‘M.9’בR.5’ 的F1 杂交群体构建了17 个连锁群，包含了224 个SSR标记，42 个 RAPD 标记、18 个 SCAR 标记和 14 个 SNP 标记（Celton et al.，2009）。随着苹果基因组全序列的公布 （Velasco et al.，2010），利用全基因组重测序技术大规模开发 SNP 标记构建高密度遗传连锁图谱成为现实。2012 年，Antanaviciute等完成了以 ‘M.27’בM.116’ F1 代杂交后代为群体，构建了由306个SSR标记和2272个SNP 标记组成的高密度遗传连锁图谱，平均每一个标记间的遗传距离为0.5 cM （Antanaviciute et al.，2012）。同年 Khan 等构建了包含2033个SNP 和843 个SSR共2875个分子标记的苹果整合遗传图谱，总长为1991.38 cM。DNA指纹图谱因具有高度的特异性、稳定的遗传性和体细胞稳定性的特点，因此不受植物组织和器官的种类、生长发育阶段、环境条件等因素的影响，所以在苗期即可对品种进行快速、有效的鉴定，提高了鉴定的准确性和效率。高质量的指纹图谱不仅可以应用于种质资源亲缘关系的分析，遗传多样性的研究，还可以通过对苹果 DNA 指纹图谱的比较分析，从本质上找出生物个体间的差异，实现对苹果栽培品种的鉴别、新品种登记、注册和产权保护。Koller等 （1993） 利用RAPD标记对11 个苹果栽培品种进行了鉴别。Gianfranceschi等 （1998） 利用两对SSR 引物对19 个苹果栽培品种的DNA进行扩增，成功的将 17 个苹果品种区分开来。祝军等（2000a） 应用 AFLP 技术，用筛选出的引物P32M46 绘制了我国苹果生产中常见的 25 个重要品种的 DNA 指纹图谱，通过对该指纹图谱的分析表明，苹果栽培品种在 DNA结构组成上具有较高的遗传多样性。祝军等 （2000b） 还利用AFLP 引物 P44M64 构建了5 个苹果矮化砧木基因型的DNA 指纹图谱，区分了供试的5 个矮化砧木的基因型并确定了他们之间的遗传关系。Liu等 （2014） 利用8 对SSR引物和60个苹果样品 （包括几个栽培品种和 ‘富士’בTelamon’ F1 实生苗）运用品种鉴定图 （Cultivar identification diagram，CID） 策略完成了第一张苹果品种鉴定图谱的构建，并证明了该方法能高效地应用于品种鉴别。分子标记辅助选择育种和基因定位克隆的前提是筛选与目的基因紧密连锁的分子标记。控制苹果重要农艺性状的基因大多属于数量性状由多基因或主效基因控制，受环境因素影响大，并且由于果树的基因高度杂和，更增加了筛选分子遗传标记的难度。目前，研究进展较快，所获得的遗传距离较近的分子标记多来自于单基因控制的质量性状。在苹果抗病性育种工作方面，研究最为广泛和深入的是对抗黑星病基因的研究。Yang 和 Krüger （1994） 首次报道了利用改进的分离分析法发现了一个与苹果抗黑星病基因Vf连锁的分子标记。随后，经过不懈的研究，不同类型的分子标记如 RAP D 标记、RFLP 标记、AFLP 标记、SSR标记等众多与苹果抗黑星病 V 基因连锁的标记被挖掘，与抗病位点连锁最紧密的分子标记的遗传距离仅为 0.5cM （Koller et al.，1994；Durham and Korban，1994；Tartarini，1996；Yang and Korban，1996；Yang et al.，1997；Tartarin et al.，1998；Xu and Korban，2000；Benaouf and Parisi.，2000；Gygax et al.，2004；Dunemann and Egerer，2010；Galli et al.，2010）。在果实品质育种方面，筛选出与控制果皮颜色主基因Rf连锁的分子标记，并将其定位在第九连锁群上 （Cheng et al.，1996；何晓薇等，2009）。与控制果实酸度、果形指数、果肉褐变等性状基因连锁的分子标记都有报道 （王雷存等，2012；Sun et al.，2012）。在矮化密植育种方面，田义柯等（2003） 筛选出一个与柱形基因Co基因位点的连锁距离为8.66 cM的RAPD标记。Moriya等 （2012） 在苹果第十条染色体上筛选出3 个与Co基因位点共分离的分子标记 （Mdo.ch10.12、Mdo.ch10.13 和Mdo.ch10.14），将Co基因定位在196 kb 个碱基区间内。分子标记辅助选择 （Molecular marker-assisted selection，MAS） 是利用与目标性状紧密连锁的分子标记作为辅助手段进行选择育种。MAS可以不用测交或后裔测定，加速遗传改良的速度；独立于环境，增加可靠性；进行育种早期选择，提高育种效率；实验室操作，降低成本；对多基因、多个性状甚至全基因组选择，增加选择效率 （徐云碧，2014）。主要应用于：种质资源的有效鉴定、量化和表征遗传变异 （Tanksley et al.，1989；Gur and Zamir，2004）；对改良目标性状的基因或数量性状基因座 （Quantitative trait loci，QTL） 的定位、克隆和导入 （Peters et al.，2003；Gur and Zamir，2004；Holland，2004；Salvi and Tuberosa，2005）；对遗传变异的操作 （包括鉴定、选择、聚合及整合） （Collard et al.，2005；Francia et al.，2005；Varshney et al.，2005；Wang et al.，2007）；植物品种保护和特殊性、均匀性及稳定性测试过程 （CFIA/NFS，2005；Heckenberger et al.，2006；IBRD/World Bank，2006） 等。MAS在苹果育种中主要应用于重要性状的筛选，杂种实生苗的早期选择，杂交亲本的选配，遗传转化中目的基因的检测等。Tartarini等（2000）报道了利用获得的与抗苹果黑星病的显性单基因Vf紧密连锁的RAPD标记测验了携带该基因个体，淘汰错误率为3%，保留错选率仅为0.02%。Cheng等（1996）利用与控制果色的Thd01基因紧密连锁的RAPD标记，在苹果实生苗发育早期进行了标记筛选，实现了对果色这一特定性状的早期选择，大大减少了人力物力的浪费。由苹果单基因Co控制的柱型性状有利于形成集约高效的现代苹果栽培模式，能够降低生产成本，提高产量。Moriya等（2012）所得到的3个与Co基因共分离的标记Mdo.chlO.12、Mdo.chlO.13和Mdo.chlO.14，对于柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择、基因的克隆及转化有着重要意义。Nybom等（1990）利用M13作为探针，对64株枫树实生苗进行了DNA指纹验证，通过亲缘关系和系统分类分析，成功的实现了对其中56株枫树实生苗的身份认证。苹果炭疽菌叶枯病是近年来高发且蔓延速度极快的一种真菌病害，目前尚没有有效的药物进行预防和治疗，对于感病的品种，特别是在高温高湿的季节，一旦发病将会带来毁灭性的为害。培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择技术逐渐成为植物抗病育种的有效手段。研究苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，筛选与苹果抗炭疽菌叶枯病基因连锁的分子标记对于抗病基因的定位、构建精细遗传图谱、进行图位克隆、基因功能验证及苹果抗病分子育种有着极其重要的意义。本书采用两个高抗苹果炭疽菌叶枯病品种 （系） ‘富士’ ‘QF-2’ （‘秦冠’ב富士’ 杂交后代中的高抗品系） 和两个高感病品种‘金冠’ ‘嘎拉’ 做亲本配制了4个杂交群体 （‘金冠’ב富士’ F1代 207 株，‘富士’ב金冠’ F1代 95 株，‘嘎拉’ב富士’ F1代262 株，‘富士’בQF-2’ F1代 198 株），采用室内人工离体接种的方法对 F1单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定。首先采用 BSA （bulked segregation analysis，分离群体分组分析） 法和 SSR （simple se-quence repeats，简单重复序列） 分子标记相结合的手段筛选抗性标记，然后通过全基因重测序与BSA相结合的方法筛选与目标基因相关的SNP 标记和Indel标记，并运用高分辨率熔解曲线 （High Resolution Melting，HRM） 分析技术验证 SNP 及 Indel标记，进一步将目标基因进行精细定位，筛选与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因，以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，获得与目标基因紧密连锁的分子标记，实现抗性基因定位，为挖掘抗病的关键基因，探索病原菌与抗病基因的互作机制，实现分子标记辅助育种，提高苹果抗病育种效率打下基础。