1.利用柑橘溃疡病菌细胞悬浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右。提取小鼠脾细胞mRNA，构建的单链抗体文库重链DNA大小为350bp左右，轻链为650bp左右，经linker（Gly3Ser）4连接后单链抗体DNA大小为1.2kb左右。将单链抗体文库DNA克隆到大肠杆菌JM109中，随机挑选了9个克隆子测序表明，9条单链抗体序列都是开放阅读框，其重链分别属于VH1、VH2、VH3基因家簇，轻链属于VKⅠ、VKⅢ、VKⅣ亚基因家簇。每个单链抗体的互补决定区（CDRs）都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。2.采用核糖体展示技术对构建单链抗体文库进行了进化和富集。结果显示第一轮核糖体展示后回收的mRNA量非常少，分光光度计已测不出其浓度，反转录RCR后，扩增得到的条带非常弱，说明在原始未筛选的抗体文库中，能与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖作用的单链抗体数量较少。经过三轮筛选后，得到的mRNA量逐渐增多，经RT-PCR后，产生了比较亮的扩增条带。说明在核糖体展示过程中，抗原阳性的单链抗体得到了富集。3.将未经过核糖体展示的原始单链抗体文库DNA和经过三轮展示的单链抗体文库DNA与噬菌体表达载体pCANTAB5E相连接后，转入大肠杆菌TG1中小量表达，表达后用间接ELISA测定单链抗体与抗原的结合活性。结果表明：从未经过筛选的原始单链抗体文库中随机挑取的60个克隆子表达产物与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖几乎没有结合能力；而从经过三轮展示后的单链抗体文库中挑取的60个克隆子中有30%与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖有较好的结合能力。从三轮展示后的单链抗体文库中共挑取了180个克隆子，用间接ELISA法初筛到60株抗原阳性的单链抗体；然后用生物分子相互作用技术（biosensor，biacore）对筛选的抗原阳性的单链抗体进行了复筛，筛选了3株高亲和力的单链抗体（GX13、GX44和GX95）以用于下一步的表达鉴定。4.将筛选的高亲和力抗原阳性的克隆子从大肠杆菌TG1中转入高表达菌株HB2151中进行可溶性表达。单链抗体表达后，其表达产物主要集中于细胞周质提取物中，具有抗体活性。将浓缩的周质提取物进行SDS-PAGE电泳，显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE电泳显示，在32 kDa处有单一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白，将表达产物进行了Western blot 杂交，结果显示，与纯化后的电泳结果一致，在32 kDa处有单一的条带产生，说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。5.将筛选的抗原阳性单链抗体进行了特性研究。单链抗体（GX95、GX44、GX13）特异性强、亲和力高。其与柑橘溃疡病菌近源种Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xooc）；Xanthomonas campestris pv.campestri（Xcc）；Xanthomonas oryzae pv.oryzicola（Xoc）；及从柑橘叶片上分离的10种腐生黄单孢菌及Bacillus subtilis；E.coli 都没有交叉反应。Biacore 分析其亲和力表明，单链抗体GX95、GX44和GX13的亲和常数分别为1.98×1010 M-1、1.89×1010 M-1、3.43×1010 M-1。6.对筛选的单链抗体进行了测序。用DNAplot 软件分析单链抗体序列。结果表明：单链抗体 GX44 和GX13重链分别属于VH1基因家簇，GX95 重链属于VH3基因家簇；GX44和GX13轻链属于Vk IV亚基因家簇，GX95轻链属于Vk III亚基因家簇。用Vector NTI软件对筛选的单链抗体的序列同源性进行了分析，表明GX44 和GX13重链有89.67%的同源性，GX95和GX13具有92.53%的同源性。

企业如何才能在当今激烈的市场竞争中立于不败之地？怎样才能在竞争中取得胜利？归根结底依靠的是人，因为只有人才能创造价值。然而企业要想获得适合自身发展的人才就必须通过各式各样的培训来实现，企业的培训将给员工提供可以胜任他们职位的信息和技能。但是，对于企业管理者来说，除了具备胜任职位的基本技能和能力以外，企业更注重培训他们的团队意识、沟通能力、协作能力等管理能力。素质拓展训练就是以“磨炼意志、陶冶情操、完善人格、熔炼团队”为目的，在体验式培训中实现这一目的的。素质拓展训练起源于西方，英文outward-bound，意为一艘小船离开安全的港湾，驶向波涛汹涌的大海，去迎接挑战。二战时期，大西洋上有很多船只由于受到攻击而沉没，大批船员落水，由于海水冰冷，又远离陆地，绝大多数人不幸牺牲了，但极少数人在经历了长时间的磨难后得以生还。后来，发现得以生还的人并不是那些身体强壮的人，而是那些拥有强烈求生欲望的人。二战结束后，在英国出现了这种模仿真实管理情景，对管理者和企业家进行心理和管理两个方面培训的outward-bound管理培训。由于它新颖的培训形式和良好的培训效果，被世界各地不同的企业所采用。根据管理学理论，我们可以将管理的过程分为四个部分：计划、组织、领导和控制。我们以素质拓展训练中“扫雷”这个项目，来看一下管理过程中的四个部分是如何工作的。“扫雷”游戏是用一张分成若干方格并标上数字的地毯来模拟雷区，每一个方格的结果是有雷或是无雷，在“雷区”中间位置的两侧是分别有两个峡谷。而这个游戏的规则是每一名队员只有两次机会去“扫雷”，如果选择的方格没有雷，那么可以安全地选择前后左右的任意一格继续“探雷”。但如果选择的方格是有雷的话，就必须按原路返回，换另一名队员继续“扫雷”。这个任务获胜的依据就是在规定的时间内所有的队员都可以安全地通过“雷区”。那么，在这个游戏中将如何去应用管理学知识来实现胜利呢？我们知道，计划是每一件事情成功的第一步，在这个游戏中也不例外。作为一个团队，首先应当确定团队的目标，那就是成功走出“雷区”。在制定了这样一个目标之后，应该做的就是制定实现这个目标的计划。当计划完成之后的组织环节中，项目经理应当明确所有成员的分工、团队的分组等事宜，以便所有的成员可以各司其职，避免在项目实施的过程中出现漏洞或者人力资源的浪费。建立起一支高效的团队，在任何一个项目中都是领导环节的重要任务。在这个项目中，其实还有一点是管理者可以实践的，那就是如何去建立一支信任的团队。“扫雷”游戏在完成了一半的时候会有意设置一道障碍，那就是在两个“峡谷”之间的“雷区”全部都是有雷的，也就是要通过正常的途径是不可能通过“雷区”的。在团队成员即将取得胜利的前夕，团队将面临极为严重的信任危机，所有的人都会怀疑是不是记录路线的人记录出了问题，这时的争吵将使团队耽误相当多的时间。如果这样的情况发生了，对于管理者来说需要通过与大家沟通，使团队建立起相互的信任，共同克服困难，渡过团队面临的这一信任危机。管理过程的最后一个阶段就是控制，其实从实施这个项目的第一步起就开始了控制。当队员探雷失败的时候，其实就是表明这一步与团队的目标是不一致的，作为项目的管理者就应该及时纠正错误，派遣另一名队员寻找一条新的道路，从而达到控制的目的；在团队面临信任危机时，管理者也是通过不同的方式消除大家心中的疑虑，重新建立起团队的信任，使之与团队的目标一致。通过“扫雷”游戏，可以看出管理学是可以运用到生活的方方面面的，素质拓展训练就是通过这些看似简单实际却是障碍重重的小游戏，在娱乐与轻松中教会管理者如何运用管理学理论解决实际工作和生活中的一些琐事，使管理者在今后的企业管理中充分地信赖以及运用管理学理论，给企业带来收益。素质拓展训练的很多项目都是为了增进团队合作而设计的，例如攀爬“天梯”项目可以让队员在极为艰难的条件下体会到相互协作带来的力量；“孤岛求生”项目则可以增进队员之间的了解，培养管理者良好的沟通能力；而“背摔”项目则是要让队员在团队中建立起彼此的信任。在Stephen P.Robbins和Mary Coulter所著的《管理学》一书中认为高效团队应当具备以下的特征：清晰的目标、相关的技能、相互的信任、统一的承诺、良好的沟通、谈判的技能、恰当的领导、内部的支持和外部的支持。我们可以看出，素质拓展训练就是要增强管理者的团队合作意识，打造一支高效的团队，而高效的团队正是一个企业获取成功的关键因素之一。企业文化对企业发展的作用在当今的市场竞争中已不言而喻了，海氏集团副总裁梅尔文·斯塔克总结说：“最受赞赏公司的意见的一致程度超过我们研究的几乎所有公司。不仅在文化目标上一致，而且对公司如何争取那些目标的看法也是一致的。”可见，公司出类拔萃的关键在于文化。在素质拓展训练中，所有的参训者首先都会参与一个叫做“破冰”（ice break）的仪式，其最主要的目的就是增进彼此之间的了解，消除队员自我为中心的想法，组建成一支团队，确定团队的队名、队旗、队歌、口号等团队文化，由队员亲自创建的团队文化将是团队迈向成功的基础。当队员在体力透支意图放弃的情况下，团队的口号将是他们坚持的动力；当本队的分数落在其他队伍后面的时候，高亢的队歌将是他们奋勇追赶的声音；当队友在10米高空的木桩上失去信心的时候，挥舞的队旗将是他们勇气的源泉。在队员亲身感受到了组织文化的重要性后，必将加强员工对企业组织文化的认同感，同时迫使管理者利用各种方式建立起适合自身发展的组织文化。一位中信银行的人力资源部经理的体会是：“体验式培训方式对于加强员工对企业文化认同感很有效。尤其是新人，他们刚到新的企业，还抱着观望的态度，对新的人际关系和新的企业文化都要有一个适应的过程。体验式培训创造了一个企业了解新人、新人了解企业的机会，经过这次全员范围的体验式培训，企业里的人际关系有了明显的改善，我们人力资源部门在新员工的任用上也获得了不少直接的信息。”素质拓展训练无疑会对传统的培训方式带来巨大挑战。所谓传统培训方式，即是指由企业自行组织，通过邀请外部的专家学者担任培训讲师，定时、定点、有一定规模、脱产或半脱产，就某个专题进行为期数天或数星期的正式培训活动，采取的形式多为讲座式，辅以若干直观的教具、多媒体手段、案例分析、情景模拟、趣味技巧等。那么，素质拓展训练较之传统培训有什么优势呢？有关专家指出：阅读和听到的资讯，我们只能学到10%～15%，但体验过的事，我们却能收获80%。传统培训方式多数是员工被动的接受信息，自然收获到的东西很少，并且培训的可转换性较低，所以这种培训的效果并不明显。而素质拓展训练正是打破传统培训的枯燥，在青山绿水之间构建一系列的训练项目，使参训者在思想完全放松的状态下接受体验式培训，从而提高参训者的积极性，这样也会使培训起到事半功倍的效果。MBA教育是目前企业对管理人员采用比较多的培训方法，但是MBA教育的费用比较高。有资料显示：“中国的商学院从上世纪90年代末出现至今，短短不到10年的时间，平均学费就从2万元增长到9万元。”费用高不说，收到的效果也不一定好，很多学院通过MBA教育后，又落入只知道理论，而缺乏理论与实践相结合的尴尬局面。从邀请专家学者进行讲座的费用也不低，目前讲师平均课时收费为300～500元/小时，另加差旅费用。当然，西方式的10000美元/天更是难以接受的天文数字。而素质拓展训练的费用为600元/人左右，也就是说企业用于对一位管理者进行MBA培训的费用可以供150人进行一次素质拓展训练。而用于支付讲师授课一小时的费用也可以负担一位员工一天的素质拓展训练，并且企业在素质拓展训练后得到的效果也远大于传统培训得到的效果。意在培养起人们的团队精神、合作精神、凝聚力、勇敢、乐观等品质，这些都是企业员工所需要而平时的知识学习无法培养出来的。试想让一群平时正襟危坐的人放下手中的工作，全身心地投入像孩子们才会去做的游戏中去，本来就是让人很感兴趣的事。在精心设计的游戏中，原本就悟性很高的人们，很容易感受到平时被大家忽视的问题，比如团结才会产生效率，勇敢乐观更有助战胜困难等。有的人更是举一反三，从一个道理想到其他的道理。因为游戏深化了人们的记忆，在以后的工作中，有些人不仅性格有了变化，比以前积极主动起来，还自觉把培训的收获应用到工作和生活中去，待人接物呈现出与从前迥然不同的态度。例如，“背摔”游戏，当台下的人给台上的人做出承诺后，自己也多了一分责任，当伸出双臂去接台上摔下来的人时，是在用双臂托起别人的生命。而台上的人往下摔时，将自己的生命交给别人，也就对台下的人充满信任。通过参加这个游戏，企业所要求的责任和忠诚的品质便可以在潜移默化中培养起来。体验式训练无论从形式，还是从内容上，都适应企业员工提高素质的需要，具备现实操作性，其实用意义显而易见。中国的经济正处于飞速发展阶段，人的素质亟待提高，体验式训练在中国有着广阔的发展前景，随着人们观念的现代化，现代企业培训的趋势在于让更多的员工体验式的培训，通过体验式的培训激发员工的潜能，从而创造出更大的价值。素质拓展训练作为体验式培训重要的方面，将立足于如何帮助企业开发人的潜力，成为企业培训不可或缺的手段，打开企业培训的新思路。

黄皮原产于我国华南，在我国至少已有1500年的栽培历史，目前主要分布于广东、广西、福建、海南、台湾、四川、云南等地。越南、印度、泰国、马来西亚以及美国的佛罗里达州等有零星栽种。黄皮属于芸香科黄皮属植物，与柑橘同科，过去一直认为黄皮不会感染黄龙病病原。2006年8月，作者在广东罗定索龙镇柑橘园附近发现有些黄皮的叶片变黄，而且黄化的叶片一般从植株的顶端开始，逐渐向下扩展直至中部，这与柑橘黄龙病的黄化症状及发病规律很相似，那么黄皮的黄化症状是不是由黄龙病病原（Candidatus Liberobacter spp.）所引致的呢？黄皮是芸香科植物，同时也是柑橘木虱的寄主植物，究竟黄皮是否会发生黄龙病？其病原与柑橘黄龙病病原有何异同？值得进一步的探讨和研究。本研究从田间采集叶脉表现黄化症状的黄皮叶片，用CTAB法提取叶脉组织DNA。以α亚纲细菌的通用引物27F/1500R为外套引物，取2μl待测黄皮样品进行第一轮的PCR扩增，用已感染了柑橘黄龙病的病叶材料提取的DNA为阳性对照，健康黄皮材料提取的DNA模板为阴性对照，第一轮的PCR先进行10个循环；再以OI1/OI2c为内嵌引物，取第一轮扩增的2μl PCR为模板，在内嵌引物的引导下进行第二轮Nested-PCR扩增。通过Nested-PCR的扩增，在表现黄化症状的2个黄皮样品中则有1160bp的特异条带扩增，初步证明在表现黄化症状的黄皮样品中含有黄龙病病原。XbalⅠ酶切显示，该片段可被切成大小分别约为640bp和520bp的两个片段，初步证明黄龙病病原为亚洲种（Candidatus Liberobacter asiaticus）。扩增产物经纯化，与pMD18-TVector连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH 5α，筛选克隆重组子。对PCR产物进行测序及序列分析，结果表明黄皮黄龙病病原16SrDNA片段序列与柑橘黄龙病亚洲种16SrDNA片段序列的同源率为：98.3%～99.6%；与非洲种16SrDNA片段序列的同源率为96.8%；与美洲种16SrDNA片段序列的同源率为94.1%～94.6%；与非洲种亚种的16SrDNA片段序列的同源率94.5%。而与其他的根瘤菌、难培养菌和另外的α亚纲细菌的同源率都在87%～89%之间。因此，认为黄皮叶脉黄化的症状是由黄龙病病原引致的，称之为黄皮黄龙病，而且该黄皮黄龙病病原属于柑橘黄龙病病原亚洲种中的一个成员。系统进化树分析显示，黄皮黄龙病病原与中国柑橘黄龙病病原亲缘关系最近，推测是直可能来自柑橘黄龙病病原。过去人们对黄皮黄龙病关注较少，本研究从分子水平上证实了黄皮确实会感染黄龙病，建议今后在黄皮生产上应重视黄龙病的问题。但由于黄皮植株内的黄龙病病原含菌量却要比柑橘植株体内的要低得多，而且黄皮也较少表现柑橘黄龙病的典型的斑驳症状，这是否和黄皮的生理特性或者是其体内的某种物质有关，值得深入研究和探讨。

水稻条纹叶枯病由灰飞虱传播的发生严重的病毒病，近几年来该病在诸暨市发生面积不断扩大，发病程度越来越重，对水稻安全生产构成重大威胁。抗性品种选育推广是防治条纹叶枯病最经济有效的措施，为此，我们对诸暨市引种试验的晚粳糯新品种（系）和在本市进行的全省联合检验的晚粳糯新品种（系）系，进行了条纹叶枯病田间自然发病的抗性测定，现将结果报告如下：分4组处理。第一组本地引进试种品种，E44、杂2、杂1、杂3、杂4、杂5、浙粳22、E8、F104、加优04-1、加优06-1等11个新品种，以甬优1号作对照品种；第二组12个全省联合检验品种（系）（简称联检），春优59、05G354、浙优2611、春优658、05G361、浙优0630、春优6172、05G227、嘉花一号、A/XR155、05G290、嘉优06-2、八优158、秀水63（对照）等13个品种；第三组作苗情观察，浙糯5号、春江糯2号、浙粳22、春江026、春江026、加优06-1、加优04-1、秀优5号、加优1号、E8、甬优2号、甬优1号等12个本地推广品种；第四组全省展示品种，秀水63、E8、浙粳22、秀水09、秀优5号、春江026、浙优9号、加乐优2号、甬优5号、加优1号等10个品种。由迁入试验小区的灰飞虱自然传毒接种。引种品试和联检在江藻镇陈潘村进行，每个品种重复3次种植，随机区组排列，5月30日播种，6月24日移栽，小区面积13.3m2，株行距品试为23.3cm×20cm，联检为30cm×16.7cm。苗情品种分别在江藻镇陈潘村和浣东街道泰南村种植作两地观察，5月30日播种，6月25日移栽，小区面积陈潘村100m2，种植2352丛，泰南村20m2，种植516丛。展示品种分别在王家井镇楼许村和枫桥镇择墅下村两地种植，每个品种种植667m2以上，择墅下点在5月22～23日播种，6月18～20日移栽，楼许点6月2～3日播种旱地育秧，6月18日左右移栽。所有处理除条纹叶枯病没有进行专门预防外，其他病虫均进行常规防治，每个试验或观察区肥水管理基本一致。8月下旬水稻未抽穗时调查；调查数量为，品试或联检试验及苗情观察的品种全小区调查，展示品种每块田调查500丛，记载发病丛数、株数和5丛的苗数。计算丛发病率和株发病率，并作统计分析。引种试验品种和联检品种的条纹叶枯病发生况调查结果见表1和表2。引种试验品种中的E44、E8、F104、杂5等没有条纹叶枯病的发生，与其他品种相比达显著或极显著差异，而杂1、加优06-1、浙粳22、杂4和加优04-1等品种的丛发病率和株发病率分别在1%和0.2%以上，浙粳22和加优04-1发病程度最重，对照品种甬优1号发病最轻。联检品种中代号1、2、3号和8号没有条纹叶枯病发病，代号9、10、11、12号丛发病率和株发病率分别在1%和0.2%以上；另外，丛发病率在1%、株发病率在0.2%以上的还有代号4号和7号。联检品种中除代号10发病程度重，与其他品种比较有显著性差异外，其他品种间差异不显著。苗情点品种条纹叶枯病抗性测定结果见表3。在两地种植都没有发生条纹叶枯病的有E8，而丛发病率和株发病率分别在1%、0.2%以上的品种有浙糯5号、春江糯2号、加优06-1、加优04-1和加优1号，其中春江糯2号发病最重，与E8比较有显著差异，但与其他品种间无显著差异；秀优5号丛发病率1%、株发病率0.2%。品种平均发病丛发病率（%）株发病率（%）E440.00cB0.000cD杂20.86bAB0.210bBCD杂11.05abA0.257bABC加优06-11.05abA0.140bcCD浙粳221.63aA0.407aABE80.00cB0.000cD杂30.09cB0.009cD甬优1号0.09cB0.018cD杂41.21abA0.257bABCF1040.00cB0.000cD杂50.00cB0.000cD加优04-11.48abA0.427aA表1 引种试验品种条纹叶枯病发生情况表（浙江诸暨，2005～2006）品种代号平均发病丛发病率（%）株发病率（%）10.00bA0.000bB20.00bA0.000bB30.00bA0.000bB40.79abA0.340bAB50.00bA0.000bB60.32bA0.097bB70.95abA0.207bAB80.00bA0.000bB91.27abA0.510bAB101.90abA1.227aA111.11abA0.207bAB121.43abA0.253bAB130.48abA0.050bB表2 联检品种条纹叶枯病发生情况表 （浙江诸暨，2005～2006）品种丛发病率（%）株发病率（%）陈泮点泰南点平均陈泮点泰南点平均浙糯5号0.461.931.195aA0.080.410.245abA春江糯2号0.565.232.895aA0.150.780.465aA浙粳220.38—0.380.075—0.075春江026选0.04—0.040.007—0.007春江0260.17—0.170.016—0.016加优06-10.173.41.785aA0.0240.520.272abA加优04-10.531.871.2aA0.430.340.385abA秀优5号1.020.940.98aA0.240.160.20abA加优1号0.852.641.745aA0.130.420.275abAE8000.00aA000.00bA甬优2号0.510.340.425aA0.0760.030.053abA甬优1号0.170.0850.128aA0.0180.0290.024abA表3 苗情点品种条纹叶枯病发病情况（浙江诸暨，2005～2006）展示点品种抗条纹叶枯病测定结果见表4。在展示的10个品种中，E8在两地都没有发现病苗，丛发病率1%、株发病率0.2%以上的品种有浙粳22、秀水09、春江026和加优1号，这4个品种在两地都有发病，择墅下点重于楼许点；而秀优5号、浙优9号、加乐优2号和甬优2号在枫桥择墅下点均有发病，分析发病程度差异的原因可能与播种时间和方式不同有关。品种丛发病率（%）株发病率（%）楼许点枫桥点平均楼许点枫桥点平均秀水630.20.60.4aA0.010.060.035aAE8000.0aA000.000aA浙粳2212.81.9aA0.120.630.375aA秀水091.23.22.2aA0.170.560.365aA秀优5号010.5aA00.140.07aA春江02622.22.1aA0.240.490.365aA浙优9号01.20.6aA00.290.145aA加乐优2号00.60.3aA00.070.035aA甬优5号00.20.1aA00.040.02aA加优1号0.63.82.2aA0.121.210.665aA表4 展示品种发病情况调查表（浙江诸暨，2005～2006）从多点试验可以看出，多数晚粳糯品种（系）不抗条纹叶枯病，只是发病程度有轻重而异，而E8在多点调查或试验中都没有发现条纹叶枯病的发生，从种质资源看它是一个籼粳交品种，2006年浙江诸暨市进行较大面积示范种植，显示出产量较高、品质较优、抗病性较好、但耐肥能力较差的特性，具有一定的推广价值。其他如E44、F104、杂5等也有较好抗病表现。调查观察表明，甬优6号和甬优8号没有发生条纹叶枯病，甬优系列的其他品种发病也较轻，如甬优1号、甬优2号、甬优5号，几年调查结果趋势基本一致。但是秀优5号、加优1号和秀水09等品种，对条纹叶枯病比较容易感染，且发病程度较重，对这些品种种植区，条纹叶枯病的防范要采取更加严格的措施。

企业是以盈利为目的的，制造企业也不例外。制造企业要想健康发展就必须把生产出来的产品卖出去，赢取利润，只有赚钱的企业才会有好的发展。因此，目前在很多的制造企业当中就形成了这样的观念：市场营销是制造企业的核心竞争力。他们的论据很简单：产品生产出来，做得再好卖不出去赚不到钱，质量再好也没用；反之，即便是垃圾，通过合理的营销模式能够卖出去也是成功的。这种想法是有一定道理的，但是过分抬高市场营销的地位，会导致让树枝遮住了树干。在河南有一家水泵生产厂家，销售人员的数量与一线工人差不多，因为老板深信只要把产品卖出去就能让企业有发展。他们的销售人员全国各地跑订单，起初阶段，公司发展迅速，由于销售人员营销有道，接到全国各地很多订单，公司的生产规模很大，工人加班加点赶生产进度。然而，经过调查发现这家公司的利润却很低，原因何在呢？因为公司只注重生产进度，忽视了产品质量，致使产品的返修率很高，仅三包费用就已经相当于其全部利润。随着时间推移，公司的回头客越来越少，同时在行业中也产生负面影响。因此，制造企业在确定自己的企业发展目标的同时，就必须首先确定自己的核心竞争力，事实证明，产品质量的优劣直接决定着制造企业的发展，是制造企业的根本。只有确立了这个根本，再辅以良好的市场营销模式，企业才能够像大树一样茁壮成长，才能够健康发展。提高产品质量不能只停留在口头上，寻找适合企业的质量管理体系是企业发展的重中之重，是每个制造企业必须研究的课题。一般来说，制造业的产品质量控制包括以下部分：控制产品材料的质量，即毛料质量，它决定产品的最终质量；产品零件加工过程中的质量控制；产品组装过程中的质量控制；产品售后服务质量的控制。影响产品质量的因素应该包含职工的素质、加工设备的能力和生产管理的科学性。在这些因素中，加工设备的能力是相对固定的。而人是最重要、最灵活、起决定性作用的因素。提高员工质量意识和员工参与质量管理的积极性，对于质量管理体系的合理建立十分重要。合理的质量管理体系应该遵循六大原则：● 以客户为中心：企业依存于其客户，因此，企业应当了解掌握客户目前和以后对产品的需要，制定相应的措施，保证能够满足客户对于产品质量的要求。● 充分发挥领导的作用：领导者将本企业的宗旨、方向和内部环境统一起来，并营造使员工能够充分参与实现企业目标的环境。● 必须全员参与：各级人员是企业之本，只有他们的充分参与，才能使他们的才干为企业带来最大的收益。这也就是以人为本的管理理念。● 科学过程方法：过程的控制对于制造业来讲也就是要在生产过程中，充分合理的利用有效资源，包括设备资源、人力资源等等，创造最大的生产能力。● 科学管理的系统方法：要根据制造企业的实际情况制定合理的、行之有效的管理文件，来约束职工的质量行为。● 具有持续改进的特点：质量管理体系必须具有持续发展的能力，要随时根据市场状况以及企业自身的经营状况进行改进，持续的改进质量管理方式才是企业发展的保证。质量管理必须是全面的、全过程的、全员参加的。全面质量管理中的质量不仅包括一般质量特征，而且包括成本质量和服务质量，它不仅包括产品质量而且还包括工程质量、工作质量。全过程的质量管理包括：产品设计、各个加工车间的生产合理化安排、制造毛料的控制、工艺文件的合理化、加工设备的合理使用等，也就是从采购开始到产品出厂的全过程的质量管理。在这个过程中就要求全员参与质量管理。产品的质量是企业素质的综合反映，涉及全体部门和员工，提高产品质量需要靠全体员工的共同努力，质量管理人人有责，从企业的领导人员到每个员工，都要学习，运用科学质量管理的理论和方法，提高本职工作质量。全员参与指的是要推动全员参与，对全过程进行质量控制与管理。以人为本，充分调动各级人员的积极性，推动全员参与。只有全体员工的充分参与，才能使他们的才干为企业带来收益，才能够真正实现对企业全过程进行质量控制与管理，并且确保企业在推行全面质量管理过程中，采用系统化的方法进行管理。制定质量管理体系必须做好以下几个方面的工作：第一，强化员工质量意识。“人”在质量管理体系中处于主导地位，起着决定性的作用。所以对企业员工的“质量意识”提升就显得更为重要。那么什么是质量意识呢？质量意识是一个企业从领导决策层到每一个员工对质量和质量工作的认识和理解，这对质量行为起着极其重要的影响和制约作用。提高质量意识需要企业管理者和全体员工的共同努力。首先企业管理者要以质量为中心，将质量管理贯穿于企业发展的全过程，通过优质的产品和满意的售后服务，使企业快速发展壮大。此外，利用多种宣传形式，加大宣传力度、强化质量意识，使员工在头脑中牢固地树立“质量第一”的思想意识。让员工在宣传活动中既强化了质量意识，又加强了自觉性和责任心。纵观国内外成功企业可以看出：企业应在质量意识教育中，培植企业文化，增强职工的团队精神，才能真正把全面质量管理落实到实处，充分体现质量意识的内涵和意义。第二，制定标准化的工作体系，包括技术标准、检测标准、工作标准等。其中工作标准是指必须根据实际情况制定不同职工的岗位标准，使每位职工都能够各司其职，充分发挥职工能动作用。第三，掌握准确的质量信息。质量信息是反映产品质量和供、产、销各环节工作质量的数据、原始记录，以便在产品使用过程中形成的各种数据和资料，加以汇总、整理、分析而得到的情况。第四，制定合理的质量监督措施。质量监督包括企业内部的质量审查和经过专业质量审查部门的审查（ISO9001认证等）。质量管理体系文件编制工作结束后即开始生效，质量管理体系投入运行实施。要重点对员工进行教育和培训，掌握全面质量活动的程序管理要求，明确各自的职责和权限，提高员工执行质量管理体系文件的自觉性和责任感。质量管理体系运行控制机制示意图质量管理体系改进是产品质量改进的重要组成部分，是质量管理的主要目的之一，重点是提高质量体系的有效性和效率，为企业及其客户和其他受益者提供更多收益的质量改进活动。企业质量管理体系改进重点是：把满足客户的期望和需要作为推进质量体系改进的基本动力；改进质量体系在资源配置上要充分考虑知识、技术、手段的更新和满足动态管理的要求，在战略上确保质量体系能够更好地服务于企业获得长期成功的总体目标的实现，要把提高质量体系的有效性作为质量改进的主要目标。在质量体系改进过程中，应尽量减少损失，降低质量成本，增长经济效益，有效利用资源，发挥现有资源的使用效率。在经营思想上要强化“面向客户，让客户满意”的理念，明确以“长远发展”而不是“眼前利益”为宗旨，倡导“树立品牌”。通过“三全”质量管理体系的实施，企业可以从采购开始进行合理的控制，提高毛料的质量，在生产中就可以减少由于材料问题引起的废品，减少废品率，降低成本。同时通过“三全”质量管理体系的实施，企业可以在过程控制中，更好地调动广大职工的工作积极性，更合理地对人力资源进行配置，充分发挥每个人的能动作用，减少目前企业中常见的废岗、重岗现象，节约人力成本。在此过程中，由于合理使用加工设备，可以最大程度的发挥每台加工设备的加工能力，使生产过程更加的科学化，提高产品生产的效率。品牌战略是目前企业发展的一个非常热点的话题，树立自身品牌已经成为很多企业都在追求的目标。品牌，是广大消费者对一个企业及其产品过硬的产品质量、完善的售后服务、良好的产品形象、美好的文化价值、优秀的管理结果等所形成的一种评价和认知，是企业经营和管理者投入巨大的人力、物力甚至几代人长期辛勤耕耘建立起来的与消费者之间的一种信任。而质量是品牌的本质、基础，也是品牌的生命。只有优秀的产品质量作为基础，才能够树立起优秀的品牌。通过“三全”质量管理体系的实施，制造企业可以达到利用科学的质量管理文件规定职工工作范围，提高职工工作积极性，提高职工工作效率、合理利用设备能力，控制生产全过程中的产品质量和工作质量，从而提高产品的最终质量和对客户的服务质量的目标。产品质量有了保障，就能够在行业中树立企业良好的口碑和企业品牌，也就是以产品质量树立品牌。制造企业的核心竞争力不只是体现在生产的产品质量上，还有诸如售后服务等其他方面。如果每个部门每位员工都能够注重自身的工作质量，也就在不同的范围内帮助企业提高了竞争力。比如：接待部门工作质量有了保障，在客户到企业进行考察的时候能够感受到亲切的接待，给客户留下良好的第一印象；财务部门提高工作质量，能够更好地提供合理的财务数据，是企业能够更准确地进行定位；售后服务人员提高自身的工作质量，能够更好的为客户提供周到的售后服务，解除客户的后顾之忧。这些方面的质量控制，能够使企业更好地找准市场定位，为客户提供满意的服务，无形中提高了企业的市场竞争力。产品质量是制造企业的生命，是核心竞争力，制造企业必须把提高产品质量作为企业发展的前提，因此，必须制定合理有效的质量管理体系并在企业中逐步实施，制造企业也必将能够从根本上提高产品质量，形成质量品牌，提高竞争力，企业也就会得到更好的发展。

全球化浪潮的兴起预示着一个新时代的来临，管理学大师彼得·德鲁克指出：在这样的时代里，“唯一关键的事情就是创新”。技术创新在现代社会有重要的意义。对企业而言，技术创新是提高竞争优势的主要途径，是企业参与竞争的主要手段，创新能够创造差别，使企业能够寻求新的竞争机会，并据此而获得差别优势和利益。改革开放以来，中国在国际经济舞台上的迅速崛起令世人瞩目，我国企业的生存与发展环境发生了巨大的变化，在赢得众多发展机会的同时，亦面临极为严峻的考验。竞争和创新也使市场更为动荡，人们越来越清醒地认识到，技术创新能力的培育对企业获取竞争优势的关键作用，从而迫使企业要不断地开展技术创新。何谓技术创新？有人定义创新为发明加开发，换句话说，它不只是发明创造活动，还包括把产品推向市场并销售给人们的活动。因此，技术创新是科技新设想转变成一种新的或改进的新产品或新工艺，并把新的或改进的产品、工艺、物料或服务开发并转移到它们适合的工厂或市场的过程。企业核心竞争力，是近几年来企业界谈论最多的话题，也不乏有一些理论性的研究和观点上的争论。“核心竞争力”这一术语首次出现是在1990年，著名管理专家C.K.Prahalad和Gary Hamel在《哈佛商业评论》上发表的《企业的核心竞争力》（The Core Competence of the Corporation）中指出：“核心竞争力是在一组织内部经过整合了的知识和技能，尤其是关于怎样协调多种生产技能和整合不同技术的知识和技能。”按照Prahalad和Hamel的定义，企业的核心能力有三个基本特征：核心能力提供了进入多样化市场的潜能；核心能力应当对最终产品中顾客重视的价值作出关键贡献；核心能力应当是竞争对手难以模仿的能力。那么，所谓核心竞争力就是指蕴涵于企业内质中的，支撑企业过去、现在和未来竞争优势的，并是企业长时间内在竞争环境中能取得主动的核心能力。Prahalad和Hamel提出了一个“树形”模型来解释核心能力：企业是一棵枝叶繁茂的大树，其最终产品是果实，最终服务是叶子，树枝是结合产品和服务的战略业务单位，树干和主枝是核心产品，为整棵树提供和输送养分，维系生命的根系就是企业的核心能力。这一模型是要表明核心能力与核心产品相关联，但是这种关联不是因为企业有自己的核心产品，因此相应的技术和技能就成为核心能力，而是强调以核心技术和知识为基础的核心能力导致了企业的核心产品。这一模型还表明了核心能力主要是一种和价值创造过程直接相关的技术能力，只有构成企业主体部分的价值创造活动中的能力才能带来实际的价值，并通过企业的产品或服务来体现。因此，技术创新能力是企业核心能力的根基。核心竞争力以企业核心技术能力为核心，通过企业战略决策、产品制造、市场营销、组织管理以及企业文化的整合而使企业获得长期竞争优势。而企业核心技术能力又在于不断创新。在经济全球化的市场经济体系下，企业所面对的市场不再是一个国家或一个地区，而是全球化的市场，企业今天的核心技术不等于明天的核心技术。因此，只有通过不断的创新，才能保证企业的技术始终走在科学的前沿，才能成为企业的核心。因特网搜索引擎技术的发展历史让人们充分体会到竞争环境变化之快，也证实了保持竞争优势有多么困难。1994年出现了第一个搜索引擎EINet Galaxy，它是“Yahoo！”搜索技术的基础。但是，90年代末期，在该领域Google就取代了Yahoo！的主导地位，现在其他的竞争者通过更多的链接以及能够浏览更多的页面向Google发起冲击。手机公司也同样面临快速变化的市场模式。1998年，诺基亚是手机生产商家的领军者，到2002年，诺基亚在市场中落到了第四，三星成为彩屏手机的领导者。但是在2003年，诺基亚凭借带摄像头的手机打入市场，再一次成为了该领域的领军人物。我们可以看到，获取持续竞争优势需要付出多年的努力，而要在超竞争的环境中保持竞争优势则更加困难。技术是竞争优势的来源，如何把企业的技术能力转换为竞争优势更为关键，那么技术创新就是联结技术能力和竞争优势的纽带。经济发展的现实已经证明，技术创新一直是整个历史上产业发展、生产率增长以及人们生活水平不断上升的强大动力。技术创新可能是使竞争对手之间市场份额发生重大变化的唯一的最为重要的源泉，它还可能同时是造成占有牢固地位的企业死亡或让位的最经常的原因，因为它能够创造或破坏企业的利润。技术创新还常常能创造新的产业，并且能改变或摧毁现有产业。简而言之，技术创新就是现代企业竞争环境中最具决定性和毁灭性的力量。因此在市场竞争日趋激烈的今天，企业要想求得生存与发展，必须加强技术管理与技术创新管理，以提升企业的核心竞争力。技术管理与技术创新管理已成为成功企业的一种新特征，其成功之处不是对已存的人、财、物和信息资源的管理，而是对自己独特的技术资源的管理，是对企业技术创新体系的建设。技术管理的关键不是要员工在职能管理的体制下各司其职，最大效率地完成其分担的工作，而是要创造一种机制和氛围，是企业员工个人及组织的技术创新能力能够最大限度地发挥出来。而创造竞争优势则需要开发和利用企业中的技术，包括企业员工的知识、技能和思想的交流，也包括历史和现有技术的应用。企业的技术管理最终能够达到提高企业核心竞争力的目标。创新是一个民族进步的灵魂，是国家兴旺发达的不竭动力，毫无疑问也是企业发展的不竭之源。企业应通过技术创新提高产品的独创性。一个行业，一个企业，如果没有持续不断的科技创新，就没有发展的源泉。企业的技术创新体系，通常以一项核心技术或几项关键技术为核心，企业的核心竞争力往往就体现在这些核心技术的开发和利用上。于是就有了这么一个逻辑：企业核心竞争力——企业自主创新——企业的生存与发展。在思考这三者关系时，企业的生存与发展是作为企业经营者最为关心的，是工作的目的；企业自主创新是方法、是手段；而企业的核心竞争力则是能力、是根本。即：企业经营者通过技术创新和产品创新等来把握和培育好企业核心竞争力，以达到企业发展的目的。只有源源不断地技术创新，企业才能不断向市场推出新产品，不断提高产品的知识含量和科技含量，改进生产技术，降低成本，进而提高顾客价值，提高产品的市场竞争力和市场占有率，并适时开拓新的市场领域。跨国公司都非常重视技术创新，设有专门的研发部门，并不断加大对技术创新的投入，以此增强企业的创新能力。据统计，世界500强的研发投入占销售收入的比重平均为5%～10%，大大高于中国企业的平均比重。2001年当国内各彩电品牌在大打价格战时，沉寂多年的索尼在中国市场仅50万台高端彩电的销售量所获得的利润就相当于国内所有彩电品牌的利润总和。“技术的索尼”的威力显露无遗。与国外知名企业相比，中国企业普遍存在的一个问题便是对技术创新不够重视，忽视对新技术、新产品的研发投入，在研发方面的投入过低自主创新能力不强，而满足于以设备制造商方式赚取微利，动辄打“价格战”。由于历史原因，中国的许多企业还未从计划经济时代“生产工厂”的角色中完全脱胎出来，很多企业没有专门的研发部门，对技术创新的投入长期处于很低的水平上，这就直接导致了当前中国企业自主创新能力普遍较差的局面。因此我国企业必须制定技术创新战略，建立符合技术创新功能要求的组织机构，建立保证技术创新顺畅运行、互相衔接、及时反馈的运行程序以及科学的现代管理，建立能够鼓励技术创新并在一定程度上自主控制技术的管理体系；并围绕与高校、科研机构联合攻关，或形成研发战略联盟，从而大大提高企业的技术创新能力，以提高企业核心竞争力。技术创新战略决定企业创新的具体行为。企业能否正确选择并贯彻实施良好的创新战略，是其能否顺利推进技术创新，赢得创新利益的先决条件。那么如何选择正确的创新战略是企业面临的重大问题，是涉及企业生存与发展的根本前提。由于技术创新活动主要源于市场拉动或技术推动及两者结合，因此技术创新活动一方面要立足市场，另一方面要把握科技发展潮流。由于全球化浪潮不以人的意志为转移地到来，要求企业及早地融入全球化环境中。借鉴国外企业创新战略的经验，下面几种创新战略可以供我国企业选择、探索。● 自主创新战略。自主创新战略是当今国际上一些成功的知识型企业为在竞争中取胜而较多采用的创新战略。它所需的核心技术来源于企业内部的技术突破，是企业依靠自身力量，通过独立的研究开发活动而获得的。对于自主创新的企业来说，在技术开发方面，由于能在一定时期内掌握和控制某项产品或工艺的核心技术，这在一定程度上左右了行业或产品技术发展方向；同时由于自主创新者一般是新市场的开拓者，因而可处于完全独占性垄断地位。● 模仿创新战略。模仿创新战略的核心是快速高效而特别的技术积累。首先，向成功的率先创新企业学习，模仿创新活动，快速而有效地增长创新知识和技能。企业的技术积累中包含大量暗默性的知识和技能，模仿却能够让一个企业在不解析原理和结构的情况下，有效地“复制”另一个企业的知识技能而丰富其技术积累，再在此基础上消化吸收，进行新的探索，而在技术积累方面青出于蓝而胜于蓝。其次，在模仿创新中实现高效的技术积累，再在高效的技术积累基础上将技术积累的重点后移，即将注意力和主要资源投入到工艺、批量生产、质量控制等环节，在这些方面形成丰厚的技术积累，从而建立起核心竞争能力。● 联盟创新战略。当今世界全球性的技术竞争不断加强，企业技术创新活动中面对的技术问题越来越复杂，技术的综合性和集群性越来越强，即使是技术实力雄厚的大企业也会面临技术资源短缺的问题，单个企业依靠自身能力取得技术进展越来越难。因此，以企业间的分工合作方式进行重大的技术创新，通过外部技术资源内部化，形成联盟以实现知识资源共享和优势互补，成为新经济形式下企业技术创新的必然趋势。通过联盟各方技术经验和教训的交流，集中各方智慧，能为参与联盟的企业赢得市场，带来经济效益，使知识增值，提高企业在市场竞争的地位。随着全球经济一体化，市场、制造全球化的发展，世界已经步入全球化新时代，为应对全球化竞争，我国企业走向全球化已势在必行。因此提高技术开发与创新能力，获取技术与竞争优势尤为重要，在全球范围内获取与保持持续竞争优势实现持续发展也成为重中之重。结合技术创新战略，企业有效地采取与实施全球化战略与管理是中国企业走向全球化、获取全球化发展的根本出路。

Keywords:Magnaporthe grisea;pathogenicity;T-DNA insertional mutants;gene function稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr.，无性世代为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc.]侵染水稻引起的稻瘟病是水稻“三大病害”之一[1，2]，严重限制世界水稻产量，但迄今为止对其致病性及其变异的机制了解得仍然不够透彻。已知水稻与稻瘟病菌之间的特异性互作，符合Flor提出的“基因对基因”关系假说[3]。对稻瘟病菌无毒基因的研究，将有助于进一步了解稻瘟病菌致病性变异的机制以及水稻与稻瘟病菌之间分子水平特异性互作的机制。目前，通过遗传分析或分子标记技术，已鉴定了至少30个稻瘟病菌无毒基因[4～7]，其中仅有5个无毒基因（PWL1、PWL2、AVR1-CO39、AVR-Pita、ACE1）被克隆[8～12]。此外，稻瘟病菌的侵染过程是一个错综复杂的循环过程，涉及一系列形态结构与生理生化的变化，故而除了无毒基因之外，与稻瘟病菌致病过程有关的基因的研究也是研究者关注的焦点，目前已经克隆和分析了包括MPG1，CPKA1，PTH11，PMK1，MPS1，MAGB，MAC1，PDE1，PSL1，TPS1等40余个参与稻瘟病菌生活史各个阶段的功能基因[13，14]。稻瘟病菌基因组全序列测定已经完成[15]，伴随着生物信息学的飞速发展，进一步以功能基因组学的研究方法从全基因组水平研究水稻与稻瘟病菌之间特异性互作的分子机制、诠释关键基因的功能已经成为解决持久抗瘟问题的关键所在。本研究正是通过接种筛选本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054 B T-DNA插入突变体库，获得致病性变异稳定的突变体，运用TAIL-PCR方法获得了突变体被T-DNA标记的侧翼序列，并通过一系列表型分析、分子生物学实验及生物信息学分析初步分析了T-DNA插入区域的基因功能，为进一步获得相关病菌小种的无毒基因或与致病性相关的基因奠定良好的基础。稻瘟病菌菌株FJ95054B，是本研究的野生型对照菌株，由本实验室从福建田间单孢分离得到的菌株；供筛选的突变体菌株，是随机从本实验室已建成的稻瘟病菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库中抽取的。供接种筛选的水稻品种CO39近等基因系：C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b及感病对照CO39，由国际水稻研究所提供。稻瘟病菌菌株的活化、扩大培养及产孢方法参照王宝华等[16]，育苗及接种方法参照张学博等[17]。接种后8～10 天，采用目测法调查并记载各品种水稻叶片上的病斑反应型。病斑反应型的记载标准参照Valent等[18]的方法，具体分级标准如下：0级：无病斑；1级：只有针尖大小的褐色斑点（病斑直径可达0.5cm）；2级：直径约0.5～1mm褐色病斑，病斑有明显黄褐色中心；3级：直径约为2mm的褐色眼状病斑，中央灰色，边缘褐色；4级：长约3～4mm中等大小的灰色梭形病斑，边缘褐色；5级：病斑达到最大（CO39的眼状病斑最长约为5mm），甚至多个病斑连片，叶枯死，如出现暗绿色急性病斑或叶节瘟也属于这一类型。其中，0～2级记为抗病反应，3～5级记为感病反应。参考李宏宇方法[19]，观察所获得突变体的形态特征及其生长发育过程，记录菌落直径、产孢量、孢子萌发率、附着胞形态和形成率以及洋葱表皮侵入情况。稻瘟病菌基因组DNA的提取参照何月秋方法[20]。TAIL-PCR反应使用的T-DNA左、右边界嵌套引物为：LB1：5'-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG-3'；LB2：5'-CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT-3'；LB3：5'-GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT-3'；RB1：5'-GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'；RB2：5'-AACGTCGTGACTGGGAAAACCCT-3'；RB3：5'-CCCTTCCCAACAGTTGCGCA-3'。使用的随机引物为AD7：5'-TG（A/T）GNAG（A/T）ANCA（G/C）AGA-3'；AD9：5'-TCGTTCCGCA-3'；AD12：5'-（A/T）AGTGNAG（A/T）ANCANAGA-3'。以上引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。10×PCR Bufer、dNTP、rTaq酶均购自宝生物公司（TAKARA）。TAIL-PCR反应程序参考文献[21]。将TAIL-PCR第2、3步扩增产物用0.5×TBE制备1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳电压为5 V/CM。电泳结束后，将凝胶放入含EB的0.5×TBE 中染色20～30min，用紫外透射反射仪观察并照相记录。TAIL-PCR扩增产物通过电泳分离后，回收目的片段，纯化后与pGEM-T Easy Vector（购自Promega公司）连接；连接产物通过热激转化到DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑反应初筛转化子；采用碱裂解法少量提取转化子中的质粒DNA，通过PCR及酶切鉴定，挑选。将含正确插入的转化子的克隆，送由上海鼎安生物科技有限公司测序。测序获得的序列去除T-DNA载体序列后，将剩余的序列与GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、稻瘟菌基因组数据库（http：//www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe/index.html）进行Blast比较分析及相关生物信息学分析，以推断T-DNA所插入的基因及其可能的功能。此外，应用SignalP 3.0 server（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）推断所获得的基因序列中是否含有信号肽（signal peptide，SNP）；应用Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）推测基因编码的蛋白可能的结构域；应用TMHMM-v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测基因编码的蛋白可能的跨膜结构域；应用Protcomp-v 6.0（http：//sun1.softberry.com/berry.phtml）对基因编码的蛋白质进行亚细胞定位，该软件可将蛋白质按细胞核、质膜、胞外分泌、细胞质、线粒体、内质网等归属进行划分；应用TargetP-v 1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进一步确定预测蛋白的亚细胞定位，其可将蛋白质的定位归属于线粒体、叶绿体、胞外分泌以及其他亚细胞定位。将随机选取的60个突变体与野生型菌株FJ95054B分别接种在国际水稻研究所提供的CO39近等基因系的6个水稻品种上，即C101LAC Pi-1（t）、C101A51 Pi-2（t）、C104PKT Pi-3（t）、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b、CO39，每个突变体都进行3个平行以上的接种试验。接种后发病情况显示：野生型菌株FJ95054B对Pi-1（t）、Pi-2（t）、Pi-4a均无致病性，对Pi-3（t）、Pi-4b、CO39致病，而在随机选取的突变体中有3个突变体的致病性发生了稳定的变异，如表1、图1所示。其中，突变体2t-2 T940024501对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，突变体T940084501和T940086501在水稻品种CO39上的致病性减弱。菌株号IsolatesC101LACPi-1（t）C101A51Pi-2（t）C104PKTPi-3（t）C101PKTPi-4aC101TTP-4L-23Pi-4bCO39FJ95054B（WT）RRSRRS2t-2T940024501/++////T940084501/////—T940086501/////—表1 稻瘟病菌T-DNA插入致病性突变体接种CO39近等基因系的发病情况*Table 1 Virulence of T-DNA insertional pathogenicity mutants on CO39 NILs稻瘟病菌侵染过程中的任何一个环节被破坏均会导致致病性减弱或丧失，因此，对致病性减弱的突变体进行相关表型分析，有助于了解其致病性减弱的原因。筛选出的两个致病性减弱突变体的生长发育变化情况如表2所示。与野生型FJ95054 B相比，两个突变体均表现出生长速度减缓、单位面积产孢量显著减少、孢子萌发率和附着胞形成率降低的性状（在α=0.05水平上差异显著）， 这些都可能是造成突变体致病性减弱的原因。图1 稻瘟病菌致病性突变体的变化情况Figure 1 Pathogenicity of mutants of M.grisea compared with wildtype FJ95054B菌株Isolate菌落直径Colonydiameter（cm）产孢量Sporulation（105spores/cm2）8h孢子萌发率Percentageofsporegermination8hpi（%）16h附着孢形成率Percentageofappressoriumformation16hpi（%）95054B（WT）5.20±0.100.7499.0693.68T-9400845014.17±0.030.001287.9073.17T-9400865014.22±0.070.003383.8963.69表2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的生长发育变化Table 2 Morphology and development of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea此外，在洋葱表皮侵入实验中，野生型FJ95054B侵入正常，能形成正常的附着胞以及侵染栓，并能观察到菌丝在洋葱细胞内广泛蔓延。相比之下，突变体T940084501的孢子能够形成附着胞，但随后并未形成侵染栓侵入，未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延；而突变体T940086501的部分孢子能够形成附着胞，但同样未能形成侵染栓侵入，也未发现菌丝在洋葱细胞内蔓延，还有部分孢子甚至不会形成附着胞。这些都可能是其致病性减弱的原因。实验结果如图2所示。图2 稻瘟病菌致病性减弱突变体的洋葱表皮侵入实验结果Figure 2 The results of onion penetration assays of pathogenicity-decreased mutants of M.grisea使用右边界嵌套特异引物RB与随机简并引物AD7组合，扩增出了突变体2t-2 T940024501的T-DNA侧翼序列（如图3A所示）；使用左边界嵌套特异引物LB与随机简并引物AD9组合，扩增出了突变体T940084501的T-DNA侧翼序列（如图3B所示）。突变体T940086501的T-DNA侧翼序列通过TAIL-PCR反应尚未获得。通过在稻瘟菌基因组数据库进行的比对分析，结果显示突变体2t-2 T940024501 T-DNA侧翼序列中的117～591 bp区段与稻瘟病菌基因组supercontig5.183的776534～777008 bp同源（同源率98%）， T-DNA 插入位点位于基因 MGG_07927.5 的外显子区，该基因位于Chromosome/Linkage GroupⅢ，编码一个假定蛋白（ hypothetical protein）， 该蛋白属于Glyco-syl hydrolases family 18（糖基水解酶家族18）。图3 TAIL-PCR第二步和第三步产物的电泳图谱Figure 3 Electrophoresis patterns of secondary and tertiary TAIL-PCR products（secondary and tertiary products of the same isolate are loaded side by side）分别利用SignalP 3.0、Protcomp-v 6.0、TMHMM-v 2.0、TargetP-v 1.1以及Pfam对该基因编码的蛋白进行分析。首先通过Signal IP 3.0预测，并不包含信号肽结构；继而经TMHMM-v 2.0预测，不含跨膜结构；通过Protcomp-v 6.0和TargetP-v 1.1分析表明，含有胞外分泌信号，是一种胞外分泌蛋白，在胞内无定位。另外，Pfam分析结果表明，该基因可能具有某种糖基水解酶活性。目前仅知该基因被T-DNA阻断后，突变体菌株对水稻品种Pi-2（t）从无毒转变为有毒，至于其在病原菌致病过程中的具体功能尚需通过进一步的基因敲除和功能互补实验加以确定。至于突变体T940084501的T-DNA侧翼序列，在稻瘟病菌基因组数据库中未比对到其同源序列，而在GenBank数据库中同样未比对到与稻瘟病菌相关的同源序列。由于该序列可能是FJ95054B菌株的特异序列，拟根据该序列扣除与载体有关序列及引物序列后的剩余序列设计引物，筛选FJ95054B BAC文库。对稻瘟病菌无毒基因以及致病过程有关基因的研究一直是了解稻瘟病菌致病性及其变异机制乃至水稻与稻瘟病菌特异性互作机制的关键所在，而研究某一个具体基因的功能最便捷的方法就是对该基因的突变体进行分析，这也正是本研究筛选T-DNA插入所致致病性突变体的初衷所在。获得致病性变异稳定的突变体是本研究的关键之一。本研究通过大量平行、重复实验初步筛选出致病性表型稳定的突变体，随后为避免由于菌株污染而造成的致病性变异的假象，还进一步将所获得的致病性突变体进行单孢分离，将分离的单孢与原菌株一同进行接种实验，结果显示单孢与原菌株的发病情况基本保持一致。这为进一步的分子水平的研究奠定了良好的基础。本研究对所获得的基因的功能还只是做了初步的预测，为了明确其功能尚需要借助进一步的基因敲除和功能互补实验。另外，为了明确致病性变异是否为单基因作用所致，尚且需要对致病性突变体的后代群体进行接种实验和潮霉素抗性分析，通过检测其后代的表型分离比率加以验证。

苹果 （ Malus pumila Mill.） 是世界上栽培最为普遍的落叶果树之一，有着很强的生态适应性，地域分布极为广泛。中国不仅是苹果属植物的发源地之一，拥有悠久栽培历史和极为丰富的苹果种质资源，也是世界上最大的苹果生产国和消费国，在世界苹果产业中占有重要的地位。近年来，我国苹果栽培面积快速增长，苹果产量和质量得到了稳步提髙。据统计数据显示，2015年我国苹果栽培面积和产量分别达到232 万 hm2和 4300万 t，居世界首位。苹果在调整农业产业结构、增加农民收入、促进地方经济快速发展等方面发挥着越来越重要的作用。病害是制约着苹果产业发展的重要影响因素。其中苹果炭疽病是苹果生产中普遍发生的一种重要病害，包括发生在果实上的苦腐病（Bitter rot of apple） 和主要发生在叶片上的炭疽菌叶枯病 （ Glomerella leaf spot，GLS）。苦腐病又被称作晚腐病，是苹果果实的三大病害之一，多在果实成熟期或半成熟期发病，主要是引起大量落果、果实腐烂，降低了果实的产量和商品价值。而苹果炭疽菌叶枯病是一种流行性很强的病害，由于该病潜育期短、发病快，在外界环境条件适宜的情况下从侵染到发病落叶仅需要3d或者更短的时间，造成树叶大量干枯、脱落，严重时形成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点，不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重地威胁着苹果产业的发展。特别是广泛种植于我国各大苹果产区的重要栽培品种 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 品种极易感病，尤其是 ‘金冠’ 在世界苹果生产国中 （中国除外） 品种比例最高，这也是选择 ‘金冠’作为苹果基因组测序材料的重要原因。它不仅是生产上的优良品种，同时也是苹果育种的核心亲本 （陈学森，2015），所以炭疽菌叶枯病的侵染不仅仅是对 ‘金冠’ ‘嘎拉’ 等品种的侵害，而可能是对 ‘金冠’ 系、‘嘎拉’ 系苹果的为害。化学药物防治是目前采用的主要防治方法，但成效甚微。所以急需培育出抗病品种从根本上解决该问题，同时也减少了果园化学试剂的使用，降低农药残留，保证果品的安全。但育种实践表明，要实现育种目标，在亲本选择与选配恰当的前提条件下，必须保证每个杂交组合有足够数量的后代群体，至少 3000株 （陈学森，2010），加上果树具有童期长 （6～12 年），基因组高度杂合，杂种后代广泛分离，自交不亲和，许多重要的经济性状是多基因控制的数量性状等特点，使得常规育种工作难度大、周期长。因此利用杂交后代早期选择技术，及早地剔除非目标基因的单株，减少杂种后代的数目，提高筛选效率，减少盲目性是提高育种效率的最实用有效的方法。随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。同时，通过构建高密度分子标记遗传图谱对重要农艺性状基因进行标记定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并验证其功能，阐明其作用机制，通过基因工程实现对果树性状的改良。因此，揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，构建精细的抗病遗传图谱对于定位抗病基因，研究基因功能，探索、掌握抗病机制，培育抗病品种有着重要的意义。苹果炭疽菌叶枯病 （ Glomerella Leaf Spot，GLS） 是近几年在中国大部分苹果主产区新出现的一种流行性很强的真菌病害。主要为害苹果叶片，造成病叶早期的干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点，导致苹果失去商品价值 （刘源霞等，2015）。该病于1988年首次报道于巴西，导致感病的 ‘嘎拉’ 苹果70%以上的叶片脱落，经鉴定其病原为围小丛壳Glomerella cingulate （Leite et al.，1988；Camilo＆Denar-di，2002；González et al.，1999，2003），为盘长孢状刺盘孢 Colleto-trichum gloeosporioides 的有性态，定名为围小丛壳叶斑病 （ Glomerella leaf spot，GLS），在中国被称为炭疽菌叶枯病。1997—1999年在巴西6个苹果产区均发现了炭疽菌叶枯病，由于‘嘎拉’ 品种是巴西的主栽品种，所以该病严重威胁着巴西苹果产业，成为巴西苹果的主要病害 （Katsurayama et al.，2000；Crusius et al.，2002；Velho et al.，2014）。1998 年在美国田纳西州的两个 ‘嘎拉’果园中暴发了苹果炭疽菌叶枯病，引起大量落叶，这也是美国首次报道苹果炭疽菌叶枯病的发生，随后在佐治亚州和北卡罗来纳州也发现了这种病害 （González，1999，2003）。我国最早于2008 年发现了炭疽菌叶枯病 （王素芳，2009），2010年相继报道了在黄河故道苹果主产区发现了炭疽叶枯病，该病引起 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果的大量落叶。尤为严重的是在 2011 年，据报道江苏丰县、安徽砀山、淮北等地栽培的 ‘嘎拉’ ‘金冠’ 等苹果品种大面积发生叶斑病，导致叶片干枯脱落，严重的造成果树二次开花 （宋清等，2012） （附图1-1）。经鉴定该病为苹果炭疽菌叶枯病，病原为围小丛壳 G. cingulata （宋清等，2012；Wang et al.，2012）。González 等 （2006）通过利用mtDNA-RFLP 对病原菌的甘油酸脱氢酶核苷酸序列进行分析，认为引起 GLS 的病原分别属于尖孢炭疽菌 C. acutatum 和围小丛壳G. cingulata。这两种菌分别归属于尖胞刺盘孢复合群和盘长孢状刺盘孢复合群 （王嶶等，2015）。王薇等 （2015） 的研究明确了在我国引起该病害的病原为果生刺盘孢 （ Colletotrichum fructicola） 和隐秘刺盘孢 （ C. aenigma），均归属于盘长孢状刺盘孢复合群。中国是否存在尖孢刺盘孢复合群的病原，还没有明确的结论。由苹果叶枯炭疽菌引起的苹果炭疽菌叶枯病症状为 （附图1-2）：在幼叶上发病时，初期表现为红至黄褐色或红褐色小点，针尖大小，边缘不规则，病健交界不清晰。在老叶上发病时，初期表现为黑色坏死性病斑，病斑边缘模糊。在7—8月高温高湿或连续阴雨的条件下，病斑迅速扩展，2～3d便可使整个叶片失水、焦枯、变黑、坏死，很快脱落。感病叶片在环境条件不适宜时，病斑停止扩展，在叶片上形成大小不等的枯死斑，病斑周围的健康组织逐渐变黄，叶片呈现花叶状，病重叶片逐渐脱落。病斑的形状多为圆形或椭圆形，也可能形成不规则的形状。病原菌侵染果实时，前期为红褐色小点，然后变为圆形或近圆形红褐色斑点，病斑周围有红褐色晕圈，中间变为灰白色，微凹。在自然环境条件下果实病斑上很少产生分生孢子，与常见的苹果炭疽病的症状明显不同。叶片上的病斑多为直径在 1～2 mm的小斑点，也有少数病斑直径超过1 cm。后期病斑中央产生黑色小点 （分生孢子盘），呈轮纹状排列，病斑上形成大量淡黄色分生孢子堆，当孢子萌发时会在病斑上产生白色丝状物 （宋清等，2012；符丹丹，2014）。苹果炭疽菌叶枯病的病原菌有性世代为 Glomerella cingulata （Stonem） Spauld＆Schrenk，属真菌子囊菌 （亚） 门，球壳目，小丛壳属，围小丛壳菌；无性世代为胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Penz.＆Sacc.和尖孢炭疽菌C. acutatum J.H.Simmonds （González，2003）。在PDA 平板上培养的菌落特征为（附图1-2e）：菌落边缘完整，呈规则圆形，气生菌丝呈絮状，比较稀疏，边缘颜色为白色中间为淡灰色。分生孢子堆呈柠檬色或橙色（符丹丹，2014）。在一般情况下，苹果炭疽叶枯病病原菌主要在苹果的休眠芽和枝条上越冬，也可以以菌丝体的形态在病僵果、干枝、果台和有虫害的树枝上越冬。5月在条件适宜的情况下产生分生孢子，成为初侵染源，越冬的子囊壳也是初侵染源之一 （宋清等，2012）。病原孢子可以随着雨水或气流传播，经皮孔或伤口侵染后，进入苹果叶片或果实内。病害发生时，首先形成中心病株，随后迅速的向四周蔓延侵染，可多次侵染，最终造成病害大面积的发生。Wang等 （2015） 的试验结果表明，温度和湿度是炭疽菌叶枯病发生的必要条件。苹果炭疽菌叶枯病病原菌分生孢子萌发的温度范围在15～35℃，最适宜温度为30℃。菌丝生长的温度范围在15～35℃，最适宜温度为25℃。炭疽菌叶枯病病原菌主要依靠雨水传播，病原菌分生孢子的萌发和侵染也需要自由水或高湿环境，而我国北方苹果主产区6—8月气温多在30℃左右，雨水充沛，满足了苹果炭疽菌叶枯病病原菌的传播、侵染和发病条件，是苹果炭疽菌叶枯病病害发生的高峰期。植物虽然在充满多种潜在病原微生物的环境中生长，但是在多数情况下植物并不表现出感病，这表明，植物在与病原微生物共同进化过程中，为了防御病原微生物的入侵，逐渐形成一套天然的免疫系统（Takken et al.，2009；Boller et al.，2009）。研究表明，病原微生物表面存在着一些保守分子，而且很少发生变异，对维持微生物的基本生物学特征非常重要。这些保守的分子特征被称为病原相关分子模式 （Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs） （Jones and Dangl，2006），例如细菌的鞭毛蛋白 （flagellin）。这些保守的分子并非病原微生物所特有，而是广泛的存在于微生物中（Zipfel et al.，2008），所以它们也被称之为微生物相关分子模式（Microbe-associated Molecular Pattern，MAMPs）。真菌的病原相关分子模式主要包括多聚半乳糖醛酸内切酶、麦角甾醇、木聚糖酶以及细胞壁衍生物葡聚糖和几丁质等；细菌的病原相关分子模式主要包括冷激蛋白、脂多糖、延伸因子 （EF-Tu） 及鞭毛蛋白等，卵菌的病原相关分子模式主要包括 β-葡聚糖及转谷氨酰胺酶等 （Van et al.，2008；Naito et al.，2008）。与之相对应，植物的细胞表面存在着识别病原相关分子模式的模式识别受体 （Pattern Recognition Receptors，PRRs）。P RRs是一类跨膜蛋白，具有高度的灵敏性和专化性，大都是存在于细胞表面的受体激酶或者具有亮氨酸重复序列的受体样蛋白 （LRR-RLP） （Fritz-Laylin et al.，2005）。例如，鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Gomez-Gomez，et al.，2000；Chinchilla，et al.，2006）、水稻几丁质酶的识别受体CEBiP （Kaku et al.，2006）、延伸因子的识别受体EFR （EF-Tu receptor） （Zipfel et al.，2006）、水稻 Ax21 的识别受体 XA21 （Park et al.，2010）、拟南芥几丁质酶的识别受体CERKl （Miya et al.，2007；Wan et al.，2008）、水稻几丁质酶的识别受体OsCERK1 （Chen et al.，2010）等。在病原微生物与植物表面接触的瞬间，植物通过其细胞表面的PRRs感知病原微生物的 PAMPs，从而识别各类微生物，激活一系列的信号元件，启动植物的先天免疫反应 （Zhang，2010）。这种通过植物的PRRs感知 PAMPs并启动的主动防卫反应被定义为植物的基础抗性 （Basal Disease Resistance），也称为基础免疫 （Basal Immunity） （Boller et al.，2009）。该免疫过程被称为病原物相关分子模式触发免疫 （PAMP-triggered Immunity，PTI），可以激活植物体内的一系列抗病反应，包括激酶的活化、胼胝质沉积、PR-蛋白的表达以及miRNA 的合成等 （Navarro et al.，2008），从而帮助植物阻止了环境中绝大多数病原微生物的入侵 （赵开军等，2011；柏素花，2012；程曦等，2012）。在PTI中，研究最为清楚的 PAMPs 及其相应 PRR 是细菌的鞭毛蛋白以及拟南芥中鞭毛蛋白的识别受体 FLS2 （Flagellin-sensing 2）。鞭毛蛋白是一种构成细菌鞭毛的粒状蛋白。在对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 的序列分析中发现，其鞭毛蛋白 N 端存在着一个肽段 （flg22），含有22个氨基酸，具有激发子活性。该区域在革兰氏阴性菌中高度保守 （Felix et al.，1999）。Chinchilla等 （2006）发现在模式植物拟南芥中，鞭毛蛋白的识别受体是富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶 （Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK） FLS2。LRR-RLK是一类单跨膜蛋白，通常由富含亮氨酸重复序列的膜外功能区，跨膜区以及胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区组成。FLS2能特异性识别并结合 flg22。现已证明番茄、烟草以及水稻中的FLS2 同源蛋白均对鞭毛蛋白具有识别功能 （程曦等，2012）。水稻白叶枯病菌 （ Xanthomonas oryzae pv.Oryzae） 的病原相关分子模式（PAMP） 是N末端具有一个硫酸化肽段 （axYS22） 的蛋白 Ax21，由17个氨基酸组成。 axYS22 结构在所有黄单胞菌属细菌中高度保守。而在水稻中能够结合并识别 axYS22的模式识别受体是LRRXII 亚家族的类受体激酶XA21 蛋白 （Lee et al.，2009）。几丁质是大多数高等真菌细胞壁的主要组成成份。源于几丁质的 N-乙酰几丁寡糖是许多植物的PAMP。水稻几丁质结合蛋白 （Chitin elicitor binding protein，CE-BiP） 和拟南芥的受体激酶 （LysM-containing chitin elicitor receptor ki-nase，CERKl） 是典型的真菌病原识别受体。水稻的几丁质结合蛋白是一类跨膜蛋白，带有两个胞外 LysM 基序，能够与几丁质结合，但缺少胞内蛋白激酶区域。这很可能暗示着CEBiP 介导的免疫反应需要其他受体的参与 （Kaku et al.，2006）。拟南芥的受体激酶含有三个胞外LysM基序和一个胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，它能够在体外直接结合几丁质 （Lizasa et al.，2010）。植物通过PRRs识别外来病原微生物的 PAMPs触发 PTI，成功抵挡了大部分病原微生物的侵入，保护宿主免受侵染。然而有少数病原微生物依然能够通过效应子抑制 PTI，从而成功避开宿主的防御，进而展开进一步入侵。效应子对P TI的抑制方式是多样的，一部分效应子可能促进病原物扩散或植物细胞养分渗漏 （Badel et al.，2002），一部分效应子有可能在卵菌及真菌侵染植物细胞并形成吸器外基质的过程中起到了框架结构作用 （Schulze-Lefert et al.，2003），一部分效应子则有可能对P TI过程中的一个或多个成分起到了抑制作用。在植物的许多致病细菌中都具有III型分泌系统 （Type III secretion system，TTSS）。该系统能够使致病细菌直接将效应子送入宿主植物细胞中。细菌效应子常常通过模仿或抑制真核生物的细胞功能来实现病原菌对宿主的侵染。在拟南芥及烟草中，丁香假单胞菌株 DC3000 所分泌的效应子AvrPto以及 AvrPtoB 能够成功的抑制 PTI的防卫反应并促进细菌繁殖。对这两种蛋白结构的分析表明， AvrPto可能作为一种蛋白激酶抑制剂，与FLS2、 BAK1及EFR的激酶区域相互作用，抑制了 PRRs的激酶活性 （Xiang et al.，2008），并干扰了 FLS2-BAK1 复合体的形成 （Shan et al.，2008）。 AvrPtoB是一种类泛素连接酶蛋白，其酶活性与 FLS2 的泛素化及降解有关 （Gohre et al.，2008）。丁香假单胞菌的另一个效应子 HopAI1 是一个磷酸苏氨酸裂解酶，能够使丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs） MPK3和MPK6去磷酸化，从而实现了对PRR信号的传导终止，抑制了宿主PTI的功能 （Zhang et al.，2007）。病原微生物能够通过效应子的作用抑制宿主的 P TI防卫反应，从而成功的进入宿主体内。病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的。然而在自然选择压力下，植物也相应的进化出能够特异性的识别这些效应子的受体，在植物细胞内部开启了由效应子触发的免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI） （Takken and Tameling，2009）。该免疫主要依靠抗病基因 （Resistance gene，R gene） 所编码的NB-LRR （Nucleotide binding-leucine rich repeat） 蛋白产物起作用，它们能够识别病原菌效应子，激活并介导小种专化抗性。这种抗性通常伴随有局部细胞死亡即超敏反应 （hypersensitive response，HR）。植物 NB-LRR 蛋白是植物细胞内的一类能与核苷酸结合并具有亮氨酸重复序列的蛋白质，是由一个多变的N 末端，C末端的LRR区域及一个NB-ARC结构域构成 （Elmore et al.，2011）。植物识别效应子并导致NB-LRR蛋白构象发生改变，从而将 NB-LRR 蛋白由抑制状态转变为激活状态，进一步诱导下游信号的转导 （Collier et al.，2009），从而实现对病原菌的防御反应。NB-LRR 蛋白对效应子的识别一般采用两种方式：间接识别和直接识别。间接识别大都是由病原效应子诱导特定的宿主蛋白发生修饰，修饰的宿主蛋白再激活 NB-LRR蛋白，完成抗病反应。拟南芥中的 RIN4 蛋白就是一种能够被病原效应子特定诱导的宿主蛋白。该蛋白是多种病原效应子 （ AvrRpt2、AvrRpm1、 AvrB 及 HopF2） 的靶标，在病原效应子的诱导作用下，RIN4蛋白被修饰，从而激活NB-LRR 蛋白，触发下游免疫应答。 Avr-Rpt2对RIN4的修饰作用是通过对RIN4蛋白的直接裂解完成的，从而激活NB-LRR蛋白RPS2介导的 ETI （Axtell et al.，2003）。直接识别是NB-LRR 蛋白与病原菌的效应子直接结合。例如，拟南芥中的RRS1-R 蛋白能够与茄科雷尔氏菌 （ Ralstoniasolanacearum） 的效应子Pop2 直接结合，从而启动了ETI应答 （Deslandes et al.，2003）。通过酵母双杂交实验也证明了亚麻的 TIR-NB-LRR 蛋白能够与亚麻锈病病菌的效应子Avr567相互作用，开启ETI应答 （Dodds et al.，2006）。植物与病原微生物之间相互作用并协同进化的过程被 Jones 等（2006） 总结为 “之” 字形模型 （附图1-3）：这个过程可以分为四个阶段，第一阶段：触发 P TI。植物通过 P RRs识别绝大多数病原微生物的 PAMPs，从而引发基础抗性。第二阶段：抑制 PTI。病原微生物相应的进化出效应子来抑制 PTI，避开宿主的防御，对植物展开再次侵染，此时植物对病原微生物是感病的。第三阶段：触发 ETI。在自然选择压力下，植物进化出能够特异性识别相应效应子的 NB-LRR蛋白，激发防御反应，阻止病原微生物的进一步侵染。第四阶段：避开 ETI。病原微生物通过不同的进化策略，产生新的效应子，展开新一轮的入侵。长期以来，作物的抗病育种主要使用了小种专化性抗病性 （即过敏性坏死反应类型），由于病原微生物生理小种的变异，导致作物抗病性的 “丧失”，缩短了抗病品种的使用年限。而且随着作物产量水平的不断提高，农田生态条件的变化和作物抗性资源的消耗，许多新的病害逐渐显现。再加上抗病性多与不良农艺性状相连锁，所以要培育出优良的抗病品种越来越难。抗病分子机理的研究为作物抗病育种提供了新的发展思路。一是重视 P TI的利用。植物细胞表面的模式识别受体对病原微生物相关分子模式的识别，诱导 P TI，是植物免受病害侵染的第一道防线。因此将 P TI 有效应用于作物抗病品种的选育，有望获得广谱性抗病品种。拟南芥中的受体基因 EFR 能够识别细菌延伸因子EF-Tu。Lacombe等 （2010） 利用农杆菌介导法将拟南芥中的受体基因 EFR 转入到烟草和番茄的基因组中，成功获得了转基因植株。经验证，转入 EFR 基因的植株可以抗假单胞菌属 （ Pseudomonas）、黄单胞菌属 （ Xanthomonas）、拉尔氏菌属 （ Ralstonia） 和农杆菌属（ Agrobacterium） 等不同属的病原细菌。这说明在育种中可以充分利用不同植物的模式识别受体基因来培育出具有广谱性、持久性抗性的作物新品种。二是将 ETI 与 PTI 相结合。植物大多数 R-基因是专门为识别病原微生物效应子而进化的，而病原微生物的效应子是菌种甚至小种所特有的，所以尽管植物ETI 能很强的特异性抵抗某种病害，但是也容易激发病原微生物产生新的效应子而避开原有的 ETI，使抗性消失。如果在利用 ETI 时，结合利用 PTI，便可以达到两道防线共同作用的效果，可以有效地避免大面积推广的抗病品种因 ETI的丧失而造成重大的产量损失。在育种实践中，利用P TI 抗性较好的栽培品种作为育种材料，利用多基因聚合或多基因转化将多个优良抗病基因导入其中，有利于扩大作物的抗病广谱性，改良作物的 ETI 抗性。近等基因系法 （Near-isogenic Lines，NIL） 和分离群体分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA） 是获取与抗病基因紧密连锁的分子标记的两种最经典的方法。近等基因系是指仅在目标性状存在差异的两种基因型个体，通过杂交及多代自交或回交分离而获得的群体 （Young，1998）。近等基因系法的基本原理是比较轮回亲本与近等基因系及供体亲本三者的标记基因型。当近等基因系与供体亲本具有相同的标记基因型，但与轮回亲本的不同时，则该标记就有可能与目标基因连锁 （Muehlbauer，1988）。近等基因系的建立一般需要连续自交或回交6～8 代，耗时较长，而且常会导致一些重要基因的丢失或形成连锁累赘，因而限制了它的应用。分离群体分组分析法又称近等基因池法，是从近等基因系法演化而来的，属于双尾分析中的选择 DNA 基因池法 （selective DNA pooling，SDP）。Michelmore等 （1991） 首先利用 BSA 法在没有近等基因系的条件下通过对F2分离群体进行RAPD分析，成功的从100 个引物中筛选出3 个与莴苣霜霉病抗性基因 Dm5/8紧密连锁的 RAPD 标记。该实验的基本原理是：具有相对性状 （如抗病、感病） 的一对亲本杂交，在其后代分离群体中，根据个体表型或基因型分为两组 （如抗病组、感病组），选取两组中相同数量的极端差异个体，提取DNA，并进行等量混合，构建两个相当于近等基因系的基因池 （如抗病基因池、感病基因池），并对两个基因池进行标记的多态性筛选。由于两个基因池在遗传背景上是相似的，表型上的差异就有可能是由于某一目的基因的改变而造成的。因此两池间筛选出的多态性 DNA 标记就有可能是与目的基因连锁的分子标记。将多态性分子标记在后代分离群体上进行进一步验证，就可以分析出多态性标记与目的基因是否连锁以及连锁程度 （廖毅等，2009）。分离群体分组分析法包括基于标记基因型的 BSA 法 （Giovannoni et al.，1991） 和基于性状表现型的 BSA 法 （Michelmore et al.，1991）。前者是根据已有图谱或标记信息对基因进行精细定位，后者是通过对分离群体中就某一性状表现极端差异的个体进行分组，构建两个相对性状的 DNA 池，并筛选与目的基因连锁的多态性标记，实现对基因的初步定位。BSA 法具有许多优点：如原理简单、操作方便、实用经济等，重要一点是克服了许多作物没有或者难以创建近等基因系的限制，所以被广泛应用于质量性状单基因的定位以及数量性状主效基因的定位。2007 年，Korol等对 BSA法进行了优化，在精密仪器的辅助作用下实现了对定位效应较大QTL的定位。许多学者从理论上和实践上都证明了 BSA 法对数量性状基因定位的合理性 （Wang and Paterson，1994；William et al.，1997；Chagué et al.，1997；Hill，1998；Mackay and Caligari，2000；Chantret et al.，2000）。分子标记 （Molecular markers） 是 20 世纪 80 年代以来，继形态标记 （Morphological marker）、细胞标记 （Cytological marker）、生化标记 （Biochemical marker） 三大遗传标记之后，又诞生的一种以 DNA一级序列的多态性为基础的新的遗传标记。分子标记与其他遗传标记的不同之处在于，分子标记能够直接从 DNA 序列上找出差异。因此其具有如下的优点：一是准确性高，不受组织器官、个体发育时期状况、环境条件等因素的干扰；二是检测定位多，几乎遍及整个基因组；三是共显性好，有些共显性分子标记可有效的鉴别出二倍体中纯合和杂合基因型；四是多态性高，无需专门去创造特殊的遗传材料，自然就存在着许多等位变异；五是表现为 “中性” （即无基因多效性），与不良性状没有必然的连锁遗传，也不影响目标性状的正常表达；六是遗传稳定，可靠性强，检测速度快，操作简单。根据分子标记的发展进程，可以将其归类划分为三代分子标记：第一代分子标记以扩增片段长度多态性分子标记 AFLP （Amplified fragment length polymorphism）、限制性片段长度多态性分子标记 RFLP （Restriction fragment length polymorphisms）、随机扩增多态性DNA分子标记 RAPD （Random amplified polymorphism DNA） 为代表。第二代分子标记以重复序列的重复次数作为标记，操作较为简单，易于分型，且为共显性标记，更便于进行遗传分析。其代表性标记为简单重复序列标记 SSR （Simple sequence repeat） 和简单重复序列间扩增标记ISSR （Inter-simple sequence repeat）。第三代分子标记以核苷酸多态性标记SNP （Single nucleotide polymorphism）、插入缺失标记 InDel （In-sertion-deletion）、拷贝数变异标记 CNV （Copy Number Variation） 为代表，在后基因组时代已被大量开发，并被广泛使用。这类标记的最大特点是数量多、范围广、为显性标记、易于高通量分型。SSR （Simple sequence repeat），即简单重复序列，又称微卫星（Microsatellite），是Litt等1989 年提出，Moore等1991 年创立的。由1～6 个核苷酸为单位组成的串联重复序列 （Wang，1994），是 DNA复制和修复过程中，微卫星序列内发生滑链错配或不均等重组时，导致增加或缺失一个或更多的重复单元 （Levinson and Gutman，1987；Richards，1992），广泛分布于植物和动物的基因组中 （Tautz and Renz，1984）。每个SSR两侧具有相对保守的单拷贝序列，这为设计特异引物扩增SSR序列提供了模板。由于扩增产物中基本单元重复次数的不同，就形成了SSR座位的多态性。通常经过SSR引物扩增出来的PCR产物，可以经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳进行检测其多态性。SSR分子标记的优点在于信息量大、多态性高、重复性好、操作简单、呈共显性 （Kalia et al.，2011），因此被广泛应用于作物及果树等目标基因的遗传定位、遗传连锁图谱的构建、遗传多样性的检测以及分子标记辅助育种等方面。SSR标记的开发：目前常见的 SSR标记开发的方法包括数据库检索法、构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法以及省略筛库法等。其中数据库检索法是开发SSR标记既经济又有效的方法。充分利用现有的DNA序列数据库中的信息，搜索 SSR 序列，可以轻松的获得全基因组的所有SSR引物，省去构建基因文库、杂交、测序等烦琐的工作，节省了大量的时间和财力。随着高通量测序技术的快速发展，使得如GenBank、EMBL/EBI （European Bioinformatics Institute，http：//www.embl-heidelberg.de/）、NCBI （National Center for Biotechnology Information， http：//www.ncbi.rdm.nih.gov/） 以及 DDBJ （DNA Data Bank of Japan，http：//www.Ddbj.nig.ac.jp） 等公共数据库中各物种的基因组序列、转录组序列及EST序列等不断增多。结合在线软件SSRIT （ http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool） 以及 SSRHunter 等来搜索SSR位点，利用 Primer Premier 5.0 或者利用在线引物设计软件Primer 3.0 （http：//primer3.ut.ee/） 根据位点两侧保守核苷酸序列设计特异性引物。SNP 即单核苷酸多态性，是两个DNA序列中的某个位点由于单个核苷酸的变化而引起的多态性。SNP 标记的优点在于数量多，分布广，相对稳定，易于快速筛查和基因分型。SNP 标记的开发：可以通过多种方式和方法实现对SNP 标记的检测和分析。一是质谱分析法。通过 PCR 扩增后，用质谱进行分析检测。二是HRM分析法。利用高分辨率熔解曲线 （High resolution melt-ing，HRM） 分析方法进行分型检测。三是芯片法。利用 SNP 标记芯片进行分型检测。四是测序法。通过高通量测序手段进行检测 （孙瑞，2015）。SNP 标记的开发主要依赖于含有大量测序序列的数据库，具有速度快、高通量的特点。随着测序技术的发展，特别是全基因组测序，不仅可以从全基因组中获得大量的SNP 位点，而且还可以了解到SNP 位点在基因组中的分布状况，对于我们进一步分析基因的功能及表达提供了更多的可能。基于参考基因组序列的分析方法包括：全基因组重测序 （Whole-genome re-sequencing，WGR）、转录组测序（RNA-seq） 和简化基因组测序 （Reduced-Representation Genome Se-quencing，RRGS）。全基因组重测序是对已知物种基因组序列的前提下所进行的全基因组范围内的测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。优点：快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。转录组测序的研究对象为某个体在某一特定的功能状态下所能转录出来的所有 RNA 的总和，检测的是某个体位于编码区的碱基差异。优点是能够降低成本，能够直接检测功能区碱基的序列变化，能够有效的检测分析基因的表达水平，更有可能找到直接与表型相关的 SNP 差异 （Geraldes et al.，2011；Li et al.，2012a）。简化基因组测序是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。RAD-seq （Restriction-site Associated DNA Se-quence） 和 GBS （Genotyping-by Sequencing） 技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，优点是可以大幅度地降低基因组的复杂程度，简化操作，同时不受有无参考基因组的限制，可快速有效地鉴定出高密度的SNP 位点，从而实现遗传分析及重要性状候选基因的预测。InDel是指父母本之间在全基因组序列范围内存在的差异。一个亲本相对于另一个亲本而言，在基因组中存在着一定数量的核苷酸插入或缺失 （Jander et al.，2002）。InDel标记就是根据基因组中的这些插入或缺失位点，依据一定原则，在其上下游设计一些PCR引物能扩增出包含这些插入缺失位点的碱基片段，成为 InDel标记。基于全基因组重测序的 InDel 标记是遗传标记的一个重要来源，因其具有分布广、密度高、变异稳定、多态性强、基因型判别简单、检测容易等优点，受到越来越多的关注。InDel标记已广泛应用于目标基因的遗传定位、高密度遗传图谱的构建、目的基因的精细定位、生物遗传多样性的分析、种子纯度鉴定及分子标记辅助育种等多方面。Yu等 （2003） 利用InDel标记、RFLP 标记、SSR标记构建了一张向日葵的高饱和度分子标记遗传连锁图谱。Feng等 （2005） 利用日本晴和9311 序列筛选得到的分布于每条染色体的20 对 InDel标记和53 对 SSR 标记，分析鉴定了46份粳稻和47份籼稻的遗传多样性。葛敏等 （2013） 利用生物信息学对玉米全基因组进行扫描，发现可用于开发 Indel分子标记的插入缺失位点，同时成功地运用 Indel分子标记鉴定了玉米杂交种的纯度。Hayashi等将开发的9对InDel标记成功的应用于水稻抗性基因的筛选。分子遗传图谱 （Genetic linkage map） 是不同分子标记在染色体上的位置和相对距离的排列图，遗传图谱上的每个分子标记反映的都是与遗传特征有关的相应染色体座位上的遗传变异和多态性。分子遗传图谱的构建是基于染色体交换与重组的理论，它是分子遗传学研究中的重要领域，是对基因进行定位及克隆的基础，也是遗传育种的重要依据。随着分子标记技术的发展，图谱上标记的种类越来越多，标记的密度也越来越高。起源于 “欧洲苹果基因组作图计划” 的第一张遗传连锁图谱于1994年由 Hemmat等人完成发表。该图谱以56 株 ‘Rome Beauty’בWhite Angel’ 的杂交后代为作图群体，构建了包含 360 个标记的父本和母本两个苹果品种的遗传连锁图 （Hemmat et al.，1994），实现了苹果遗传图谱构建的突破。2003 年，Liebhard 等以 ‘Fiesta’בDiscovery’ 的 267 株 F1 代杂交群体为试材，利用 SCAR、AFLP、SSR、RAPD标记等840个不同类型的分子标记构建了高密度的遗传连锁图谱 （Liebhard et al.，2003）。2009 年，Celton 等利用 93 个‘M.9’בR.5’ 的F1 杂交群体构建了17 个连锁群，包含了224 个SSR标记，42 个 RAPD 标记、18 个 SCAR 标记和 14 个 SNP 标记（Celton et al.，2009）。随着苹果基因组全序列的公布 （Velasco et al.，2010），利用全基因组重测序技术大规模开发 SNP 标记构建高密度遗传连锁图谱成为现实。2012 年，Antanaviciute等完成了以 ‘M.27’בM.116’ F1 代杂交后代为群体，构建了由306个SSR标记和2272个SNP 标记组成的高密度遗传连锁图谱，平均每一个标记间的遗传距离为0.5 cM （Antanaviciute et al.，2012）。同年 Khan 等构建了包含2033个SNP 和843 个SSR共2875个分子标记的苹果整合遗传图谱，总长为1991.38 cM。DNA指纹图谱因具有高度的特异性、稳定的遗传性和体细胞稳定性的特点，因此不受植物组织和器官的种类、生长发育阶段、环境条件等因素的影响，所以在苗期即可对品种进行快速、有效的鉴定，提高了鉴定的准确性和效率。高质量的指纹图谱不仅可以应用于种质资源亲缘关系的分析，遗传多样性的研究，还可以通过对苹果 DNA 指纹图谱的比较分析，从本质上找出生物个体间的差异，实现对苹果栽培品种的鉴别、新品种登记、注册和产权保护。Koller等 （1993） 利用RAPD标记对11 个苹果栽培品种进行了鉴别。Gianfranceschi等 （1998） 利用两对SSR 引物对19 个苹果栽培品种的DNA进行扩增，成功的将 17 个苹果品种区分开来。祝军等（2000a） 应用 AFLP 技术，用筛选出的引物P32M46 绘制了我国苹果生产中常见的 25 个重要品种的 DNA 指纹图谱，通过对该指纹图谱的分析表明，苹果栽培品种在 DNA结构组成上具有较高的遗传多样性。祝军等 （2000b） 还利用AFLP 引物 P44M64 构建了5 个苹果矮化砧木基因型的DNA 指纹图谱，区分了供试的5 个矮化砧木的基因型并确定了他们之间的遗传关系。Liu等 （2014） 利用8 对SSR引物和60个苹果样品 （包括几个栽培品种和 ‘富士’בTelamon’ F1 实生苗）运用品种鉴定图 （Cultivar identification diagram，CID） 策略完成了第一张苹果品种鉴定图谱的构建，并证明了该方法能高效地应用于品种鉴别。分子标记辅助选择育种和基因定位克隆的前提是筛选与目的基因紧密连锁的分子标记。控制苹果重要农艺性状的基因大多属于数量性状由多基因或主效基因控制，受环境因素影响大，并且由于果树的基因高度杂和，更增加了筛选分子遗传标记的难度。目前，研究进展较快，所获得的遗传距离较近的分子标记多来自于单基因控制的质量性状。在苹果抗病性育种工作方面，研究最为广泛和深入的是对抗黑星病基因的研究。Yang 和 Krüger （1994） 首次报道了利用改进的分离分析法发现了一个与苹果抗黑星病基因Vf连锁的分子标记。随后，经过不懈的研究，不同类型的分子标记如 RAP D 标记、RFLP 标记、AFLP 标记、SSR标记等众多与苹果抗黑星病 V 基因连锁的标记被挖掘，与抗病位点连锁最紧密的分子标记的遗传距离仅为 0.5cM （Koller et al.，1994；Durham and Korban，1994；Tartarini，1996；Yang and Korban，1996；Yang et al.，1997；Tartarin et al.，1998；Xu and Korban，2000；Benaouf and Parisi.，2000；Gygax et al.，2004；Dunemann and Egerer，2010；Galli et al.，2010）。在果实品质育种方面，筛选出与控制果皮颜色主基因Rf连锁的分子标记，并将其定位在第九连锁群上 （Cheng et al.，1996；何晓薇等，2009）。与控制果实酸度、果形指数、果肉褐变等性状基因连锁的分子标记都有报道 （王雷存等，2012；Sun et al.，2012）。在矮化密植育种方面，田义柯等（2003） 筛选出一个与柱形基因Co基因位点的连锁距离为8.66 cM的RAPD标记。Moriya等 （2012） 在苹果第十条染色体上筛选出3 个与Co基因位点共分离的分子标记 （Mdo.ch10.12、Mdo.ch10.13 和Mdo.ch10.14），将Co基因定位在196 kb 个碱基区间内。分子标记辅助选择 （Molecular marker-assisted selection，MAS） 是利用与目标性状紧密连锁的分子标记作为辅助手段进行选择育种。MAS可以不用测交或后裔测定，加速遗传改良的速度；独立于环境，增加可靠性；进行育种早期选择，提高育种效率；实验室操作，降低成本；对多基因、多个性状甚至全基因组选择，增加选择效率 （徐云碧，2014）。主要应用于：种质资源的有效鉴定、量化和表征遗传变异 （Tanksley et al.，1989；Gur and Zamir，2004）；对改良目标性状的基因或数量性状基因座 （Quantitative trait loci，QTL） 的定位、克隆和导入 （Peters et al.，2003；Gur and Zamir，2004；Holland，2004；Salvi and Tuberosa，2005）；对遗传变异的操作 （包括鉴定、选择、聚合及整合） （Collard et al.，2005；Francia et al.，2005；Varshney et al.，2005；Wang et al.，2007）；植物品种保护和特殊性、均匀性及稳定性测试过程 （CFIA/NFS，2005；Heckenberger et al.，2006；IBRD/World Bank，2006） 等。MAS在苹果育种中主要应用于重要性状的筛选，杂种实生苗的早期选择，杂交亲本的选配，遗传转化中目的基因的检测等。Tartarini等（2000）报道了利用获得的与抗苹果黑星病的显性单基因Vf紧密连锁的RAPD标记测验了携带该基因个体，淘汰错误率为3%，保留错选率仅为0.02%。Cheng等（1996）利用与控制果色的Thd01基因紧密连锁的RAPD标记，在苹果实生苗发育早期进行了标记筛选，实现了对果色这一特定性状的早期选择，大大减少了人力物力的浪费。由苹果单基因Co控制的柱型性状有利于形成集约高效的现代苹果栽培模式，能够降低生产成本，提高产量。Moriya等（2012）所得到的3个与Co基因共分离的标记Mdo.chlO.12、Mdo.chlO.13和Mdo.chlO.14，对于柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择、基因的克隆及转化有着重要意义。Nybom等（1990）利用M13作为探针，对64株枫树实生苗进行了DNA指纹验证，通过亲缘关系和系统分类分析，成功的实现了对其中56株枫树实生苗的身份认证。苹果炭疽菌叶枯病是近年来高发且蔓延速度极快的一种真菌病害，目前尚没有有效的药物进行预防和治疗，对于感病的品种，特别是在高温高湿的季节，一旦发病将会带来毁灭性的为害。培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择技术逐渐成为植物抗病育种的有效手段。研究苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，筛选与苹果抗炭疽菌叶枯病基因连锁的分子标记对于抗病基因的定位、构建精细遗传图谱、进行图位克隆、基因功能验证及苹果抗病分子育种有着极其重要的意义。本书采用两个高抗苹果炭疽菌叶枯病品种 （系） ‘富士’ ‘QF-2’ （‘秦冠’ב富士’ 杂交后代中的高抗品系） 和两个高感病品种‘金冠’ ‘嘎拉’ 做亲本配制了4个杂交群体 （‘金冠’ב富士’ F1代 207 株，‘富士’ב金冠’ F1代 95 株，‘嘎拉’ב富士’ F1代262 株，‘富士’בQF-2’ F1代 198 株），采用室内人工离体接种的方法对 F1单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定。首先采用 BSA （bulked segregation analysis，分离群体分组分析） 法和 SSR （simple se-quence repeats，简单重复序列） 分子标记相结合的手段筛选抗性标记，然后通过全基因重测序与BSA相结合的方法筛选与目标基因相关的SNP 标记和Indel标记，并运用高分辨率熔解曲线 （High Resolution Melting，HRM） 分析技术验证 SNP 及 Indel标记，进一步将目标基因进行精细定位，筛选与抗炭疽菌叶枯病相关的候选基因，以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，获得与目标基因紧密连锁的分子标记，实现抗性基因定位，为挖掘抗病的关键基因，探索病原菌与抗病基因的互作机制，实现分子标记辅助育种，提高苹果抗病育种效率打下基础。