菌核病为我国油菜三大病害之首，严重影响油菜的产量和品质，目前通过使用化学农药等措施对其进行防治，但是效果不很明显，且长期使用化学农药会造成对环境的严重污染。所以利用植物自身诱导抗病性对菌核病进行防治是现在农业生产中的新趋势。植物诱导抗病性是植物抵御病害侵袭的重要机制之一，具有作用效果明显，广谱性及环境友好等优点，作为一种经济有效的抗病策略，在农业可持续病害防治中具有广阔的应用前景，日益受到人们的关注。我们实验室开发研制的生物农药中科六号（壳寡糖）在田间及温室实验中被证实可诱导烟草等作物对相应的病害产生防治作用[1]；田间使用中科六号可减轻油菜菌核病对油菜的影响，故本文中利用植物生理生化方法进行温室实验及生化实验，初步探讨壳寡糖诱导油菜抗菌核病的作用机制。1.1.1 供试药剂 壳寡糖（oligochitosan、COS），脱乙酰度>95%，聚合度为3-10，由中国科学院大连化学物理研究所研制；配制成50μg/ml使用。1.1.2 供试植物 甘蓝型油菜沪油15（Brassica napus L.）温室中培养至4～6片叶期。1.1.3 供试病原菌 油菜菌核病病原菌 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）本实验室保存。1.2.1 实验设计 为考察接菌前不同时间壳寡糖预处理对诱抗作用的影响，分别在接菌前0～4天处理油菜植株。新鲜配置的50μg/ml壳寡糖溶液喷雾油菜植株，每株取两片叶子，确保其正反面均润湿，确保其他叶片未被喷上壳寡糖溶液。1.2.2 油菜菌核病接种方法 保存的菌核用70%乙醇浸泡30s，1%的升汞消毒10min，无菌水冲洗3次后，接种于PDA（potato dextrose agar）培养基中。在25℃下暗培养3～5天，待菌丝长满培养皿后即可进行接种。接种试验之前，先将4～6片叶期油菜植株喷上雾状水珠，用打孔器将菌丝截成直径为0.15cm大小的菌丝琼脂块，将有菌丝的一面与壳寡糖预处理的油菜叶片接触，每株取一片叶子，每片叶子上放一块菌丝琼脂块，然后用保鲜膜盖上，再喷一次雾状水珠，保持温度20℃左右，接种后每天喷一次水。1.2.3 病情指数调查方法 在接菌后第五天根据病斑占叶片面积比例调查病情指数，分级标准为：0=没有病斑；1=病斑面积占叶面积11%以下；2=病斑面积占叶面积11%～30%；3=病斑面积占叶面积31%～50%；4=病斑面积占叶面积51%以上。1.3.1 粗酶提取 取提前三天壳寡糖预处理植株进行试验，以正常、壳寡糖处理不接核盘菌和未经壳寡糖预处理接核盘菌的植株为对照。每个试验点选取4株植株，每株取系统叶和处理叶各一片，迅速放入液氮中保存。取样叶1.4g，10.0ml含5mmol/L巯基乙醇的硼酸缓冲液（0.05M，pH 8.8），加入0.5g PVP和石英砂在研钵中研磨，在冰水中研磨成浆。10000r/min 4℃离心10min，上清液即为酶液。考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。1.3.2 脂氧合酶（LOX）活性测定 0.1ml粗酶液与3ml 0.20mM亚麻酸溶液混匀后放入30℃水浴中反应，监测5min后OD234变化值，酶活由以下公式计算：（A234末-A234初）/0.001/总蛋白含量（mg）。用滤纸片法在PDA培养基平板上进行抑菌试验，在培养基平板正中央接0.15cm大小的核盘菌菌丝琼脂块，打孔器取直径5～6mm的滤纸片，在无菌条件下浸泡壳寡糖溶液均匀后放置平板上，每皿放置5点，其中一点为对照即浸无菌水，另设不放滤纸片的培养皿平板为阴性对照，观察不同浓度处理滤纸片后其周围病菌生长状况，与对照相比，经72h恒温培养后，根据抑菌圈大小判断抑菌效果。壳寡糖溶液浓度50mg/kg，200mg/kg，500mg/kg，1000mg/kg。依据田间试验诱抗效果取最佳浓度50μg/ml进行温室试验，试图寻找防效最好的预处理时间点。对照植株在12h时就发病明显，96h后叶片枯萎。而经壳寡糖预处理者接核盘菌后12h内症状不明显，24h时产生病症，120h后叶片出现枯萎现象（图1），说明壳寡糖处理能延缓菌核病发病，壳寡糖预处理的植株都表现出一定的抗菌核病的能力接菌（表1），提前三天（72h）预处理有最佳效果，在120h时防效为54.60%，试验结果显示防效可达120h以上。图1 壳寡糖提前三天预处理后油菜接菌核病后表型变化（0h，12h，24h，48h，120h）Figure 1 Appearance of 72h before COS pretreated B.napus leaves challenged with S.sclerotiorum.（0h，12h，24h，48h，120h）预处理时间病情指数（%）防效（%）022.91—提前24h15.6231.8提前48h14.5836.35提前72h10.4154.60提前96h12.5045.44表1 不同时间壳寡糖预处理对油菜菌核病的影响Table 1 The resistance of COS pretreated B.napus to S.sclerotiorum不同处理后油菜植株LOX的活性变化如图2所示。处理叶在只接菌和COS预处理后接菌情况下，72h小后活力提高，而COS处理的植株96h后活力才提高，且COS处理后的植株LOX活力高于只接菌者。在系统叶中获利变化更明显，在48时有一个峰值，96h水平又明显提高一个途径使SOD酶活升高。这些复杂现象说明在油菜中COS可通过多种途径诱导LOX活力升高。图2 壳寡糖和核盘菌引起的LOX酶活力变化 （A）处理叶 （B）系统叶Figure 2 Effects of oligochitosan and S.sclerotiorum on activities of LOX enzymes in B.napus leafs.（A）Treat leafs （B） System leafs如表2所示，低浓度壳寡糖对核盘菌的直接抑制作用不明显。壳寡糖浓度（mg/kg）抑菌圈直径（cm）壳寡糖浓度（mg/kg）抑菌圈直径（cm）0—5000.34±0.0550无抑制10000.75±0.11100无抑制表2 不同浓度壳寡糖对核盘菌的抑菌圈直径Table 2 The inhibitory diameter of S.sclerotiorum by different concentration COS壳寡糖作为近几年研究较多的一种植物诱抗剂，已经被广泛应用于烟草、棉花、油菜等作物生产中。然而其作用机制尚不明了，本文首次进行了壳寡糖对油菜抗菌核病的研究。发现使用50μg/ml的壳寡糖溶液预处理油菜植株，可以提高其抗菌核病能力，其抗性可持续96h以上，防效可达到54.60%。防治效果虽然没有化学药剂作用明显[2]，但与其他诱抗剂效果相当[3，4]，在环境友好前提下具有良好的防治效果。壳寡糖对核盘菌的生长没有显著抑制作用，于汉寿等人也发现壳聚糖对核盘菌的直接抑制作用也不明显[3，5]，说明喷施壳寡糖使油菜对菌核病产生抗性主要是因为壳寡糖诱导油菜产生了系统抗性，而不是来源于壳寡糖对菌核病的直接作用。提前三天预处理的植株有最高防效，说明壳寡糖诱导对菌核病的抗性可能有一个响应和滞后期，Molloy等人[6]报道壳寡糖诱导胡萝卜防治菌核病的最佳处理期也是接菌前三天，说明这种现象是广泛存在的。脂氧合酶（LOX）在植物抗胁迫响应时扮演重要角色[7]，脂氧合酶可催化多不饱和脂肪酸转化为氢过氧化物，并最终生成重要的植物抗性反应信号分子茉莉酸（JA）。Kim等人[8]报道LOX酶水平可以被JA诱导升高，我们的实验结果说明壳寡糖可同时诱导油菜处理叶和系统叶中LOX酶活性升高，揭示壳寡糖可能是通过JA酸途径诱导植物产生抗病性的，这与我们之前利用基因芯片得出的结论相吻合[9]，但具体的信号转导网络仍有待进一步研究。

灰霉病是番茄栽培中的重要病害，长期依赖农药防治该病严重污染环境和产品。利用诱导抗性是植物病害可持续控制的一条有效途径。E.A.Achuo和K.Audenaert等用适宜浓度的BTH处理土壤或叶片，显著降低番茄灰霉的发病程度[1]。众多研究表明，诱导植株下位叶片，可增强诱导叶和其上非诱导叶的抗病性[2～4]；而诱导上位叶片对诱导叶及其下位非诱导叶的抗病性的影响鲜见报道。本试验比较了5种化学物质诱导不同部位叶片对番茄灰霉病发生程度的影响，为诱抗剂的使用技术提供参考和依据。番茄品种为L402，灰霉菌（Botrytis cinerea）由田间分离所得。供试化学物质分别为：CaCl2（Calcium chloride，Ca），上海化学试剂公司生产；水杨酸（Salicylic acid，SA），沈阳化学试剂厂生产；茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MJ）、龙胆酸（Gentisic acid，GeA）和β-氨基丁酸（3-Aminobutyric acid，BABA），购自Sigma公司。番茄穴盘育苗，苗期管理与一般生产相同。6叶期用20mmol/L的CaCl2，3mmol/L的SA、MJ、GeA和9mmol/L的BABA涂抹第3叶片（下位叶）或第5叶片（上位叶）。5天后用浓度为106个孢子/ml的灰霉菌孢子悬液接种第4真叶的前5片小叶，接种方法采用微量注射法[7]。接种后第5天调查发病程度并计算病指数。病害分级标准为：0级，无病斑；1级，病斑面积占叶面积5%以下；3级，病斑面积占叶面积5%～15%；5级，病斑面积占叶面积15%～25%；7级，病斑面积占叶面积25%～50%；9级，病斑面积占叶面积50%以上[7]。每处理3次重复，数据均用SPSS软件进行统计分析。无论是诱导第3叶片还是第5叶片，番茄灰霉病发生程度均显著低于对照。其中CaCl2、SA和GeA 诱导第3叶片和诱导第5叶片，番茄灰霉病发生程度之间没有显著差异；而MJ和BABA诱导第3叶片番茄灰霉病发生程度显著低于诱导第5叶片的发病程度（图1）。这一现象说明，CaCl2、SA、GeA、MJ和BABA诱导番茄的抗病信号既可以向上传递，也可以向下传递；而CaCl2、SA和GeA诱导的抗病信号向上和向下传递的能力相同，MJ和BABA诱导番茄的抗病信号向上传递能力高于向下传递能力。Figure 1 Disease index after induced leaves at different positions of tomato试验结果表明，CaCl2、SA、GeA、MJ和BABA均可诱导番茄抗病性增强，而且诱导的抗病信号可以在植株中进行双向传递，但诱导的抗病信号向植株下部传递能力不高于向上传递能力。蔡新忠等用叶霉菌非亲和小种4诱发接种番茄第3叶片，5天后用其亲和小种5挑战接种第3叶和第4叶，结果表明，诱导植株的第3叶和第4叶发病程度均显著低于对照，发病面积下降率分别为90%和85%[2]。童蕴慧等发现，用拮抗细菌处理番茄叶片可诱导番茄抗灰霉性增加，处理叶的上一叶位叶片中PAL、POD、PPO、SOD活性均显著高于对照，处理叶和上一叶位叶片中SA含量分别是对照的2.6倍和1.6倍[3]。张穗等用井冈霉素A处理珊西烟，处理叶和其上位叶片中几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性均比对照植株相同叶位叶片显著增加，而这两种酶活性与TMV引起的烟草叶片枯斑数目呈负相关[4]。上述研究结果与本试验结果一致。所以在所用诱抗剂价格昂贵或数量不足时，建议用少量诱抗剂处理植株下位叶片来达到防病目标。

基因表达是基因在生物体内转录、翻译以及所有加工的过程，在真核生物中，约有10万个基因，而表达的基因只占基因组的15%左右，了解不同条件下细胞内基因表达的变化，可以帮助我们了解控制生命过程的机理[13]。对于植物来说，在植物不同的发育阶段和不同的环境条件下，基因的时空表达受到严密的调控。当植物受到病原物，如细菌、真菌、病毒、线虫等的侵袭时，植物体内存在防御机制，诱导相关基因表达，或者诱导相关基因表达量增加，产生次生代谢产物或表达抗性基因，从而抵御病原物的侵袭。因此研究植物基因表达变化水平对于揭示植物抗感病机理有重要的意义。在人类控制植物病虫害的措施中，抗病虫转基因植物是其中的重要手段之一，这样可以减少农药的使用，减少对环境的污染，并且符合可持续发展农业的要求，而基因表达分析又是其中必不可少的一步。它可以检测抗病虫基因能否高效的表达，以及能否在特定的发育阶段或者特定的组织器官中表达。基因表达研究方法有Northern杂交法、表达序列标签、mRNA差别显示技术、基因表达的系列分析方法和基因表达芯片等，本文对主要基因表达研究方法在植物病理学上的应用进行了简单概述。Northern杂交技术是用于测定真核生物RNA样品中特定mRNA分子的量和大小以及估计其丰度的技术，是研究基因转录产物的重要手段[14]。Northern杂交技术是在Southern技术的基础上建立起来的，具体的步骤是首先从要研究的组织或细胞中分离完整的mRNA，然后将RNA根据大小用变性琼脂糖凝胶电泳分离，再通过毛细管作用或负压法装置使RNA条带转移到纤维膜上，进行必要的处理后，用固相RNA与探针分子杂交，对特异结合的探针分子的图象进行检测、捕获和分析[15]。这种方法具有较高的特异性，主要是应用于检测特异rnRNA，以分析已知基因的表达情况。李子银等[16]根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物，从抗稻瘟水稻品种窄叶青8号第一链cDNA和基因组DNA中扩增出3个与植物抗病基因同源的序列，利用Northern杂交技术，显示其中一个基因在水稻叶片、幼茎和根中均有转录。程志强等[17]利用已知的植物R类基因保守结构域，设计简并引物作为随机引物，分析水稻愈伤组织受白叶枯病菌诱导的mRNA表达丰度差异，获得3个差异片段。Northern杂交结果证实该片段受白叶枯病菌诱导表达，且在抗性品种中的诱导表达明显强于感病品种的诱导表达。黄萱等[18]根据已知植物抗病基因的保守结构域设计引物，从抗锈病小麦品种西农88基因组DNA扩增触3条与植物抗病基因同源的序列，通过Northern杂交表明其中一个同源序列在小麦中受水杨酸调控，属于诱导型表达的抗病基因。表达序列标签（EST）技术是由Adams等[1]提出的。典型的真核基因mRNA是由5’帽子，5’-UTR，编码区，3’-UTR，3’polyA尾巴五部分组成，其中5’-UTR和3’-UTR对基因具有特异性，3’或5’端的一段序列就可以表示在某种条件下基因的表达情况[19]。表达序列标签即在不同的组织构建的cDNA文库中，随机挑选不同的克隆，进行克隆的部分测序从而产生的cDNA序列。目前，已经建立了大量的EST数据库，可以根据不同时间，不同处理、不同组织，不同条件下EST数据的比对，鉴别特异表达的基因。但是，此技术对实验室的仪器、测序、经费等要求高。马金彪等[20]利用EST技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库，通过序列分析，了解小麦与条锈菌互作过程中表达的基因，为从分子水平揭示寄主与病原菌亲和互作机理奠定了理论基础。mRNA差别显示技术，又称差示反转录PCR（differential display of reverse transcriptional PCR），简称DDRT-PCR，它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。几乎所有的真核基因mRNA分子的3’末端都带有poly（A）尾巴，在RNA聚合酶的作用下，以mRNA为模板，以oligo（dT）为引物合成出cDNA链[21]。此技术的优点在于简单方便、灵敏度高，但同时它也存在局限性，如：假阳性比例高，可达50%～70%；扩增的片段分子量比较小；工作量大等[13]。mRNA差别显示技术最初是为动物研究设计的，但是从其原理来看，在植物基因表达的研究上也存在很大的潜力，可以应用于植物抗病基因的表达研究上，研究发现，抗病基因中很多都是多基因家族，这样的多基因家族在抗、感病品种中都存在，只是其中的成员有所不同，有的基因缺失，这可能就是造成抗病品种抗病、感病品种感病的原因。所以，可以应用mRNA差别显示技术分析比较抗病品种和感病品种的差异表达的基因，从而进行进一步的分析。黄旭等[22]通过外源DNA浸泡幼胚将普通野生稻（Oryza rufipogen）抗稻瘟系YD1005总DNA导入受体粳稻寒丰S（Oryzasativa ssp.japonica）育成一抗稻瘟病变异株（D1代），利用mRNA 差别显示技术分离得到一个原品种中没有的与抗稻瘟病相关的一个cDNA。饶志明等[23]人利用mRNA差别显示技术对水稻感病品系G71受苯并噻二唑诱导3天的应答反应进行分析，从抗病及其相关基因保守结构域设计的10个引物组合的反应中获得11个受BTH诱导的cDNA差异片段，进一步利用Northern杂交证实其中一个阳性片段的表达受BTH和稻瘟病菌的诱导。由于差别杂交技术、mRNA差别显示技术各有缺点，不能够提供全面的表达分析图谱，不能够全面系统的分析基因转录组。因此，在此基础上，1995年Velculesue等[2][3]描述了一种基因表达的序列分析技术（SAGE），该技术能快速详细的分析成千上万个转录子，能够全面的对基因组的表达进行分析，而无须依赖以前的转录信息。在一个转录物中，可以找到一段特异的序列，这个特异的序列就可以代表这个转录物，该序列即转录序列标签（SAGE标签），一般为9～10bp；SAGE 标签经随机连接、扩增并集中在1个克隆中测序，标签重复出现的次数代表该转录物的拷贝数。根据其占总标签数的比例即可分析出其所对应的编码基因的表达频率。SAGE是分析诱导表达的抗病基因的一种有效的方法，Matsumara等[4]应用SAGE 技术研究水稻在白粉病菌侵染后基因表达的整体变化，旨在发现与稻瘟病抗性相关的新基因；Mitchell 等[5]利用SAGE 方法对水稻与稻瘟病菌之间相互识别及病理反应进行全基因组分析，以了解与病原菌致病力和寄主抗性相关的基因。Mysore 等[6]以番茄为材料，分析了不亲和的植物病原菌互作过程中经诱导产生或被抑制的基因表达图谱。基因芯片技术最早是由Fodor[7]等提出的，基因芯片是一种用于合成和分析生物分子的微型装置。其原理是指是指将大量生物讯息密码，以预先设计的方式固定在玻片、硅片、塑料和尼龙膜等固相载体上组成的密集分子阵列。微阵列在一定条件下进行生化反应，反应结果用化学荧光法、酶标法、同位素法显示，再用扫描仪等光学仪器进行数据采集，最后通过专门的计算机软件进行数据分析[8]。微阵列芯片主要有两种：基于寡核苷酸微阵列芯片和基于cDNA 片段的微阵列芯片。虽然寡核苷酸阵列芯片的检测灵敏度高，可检测出一个碱基的错配，但寡核苷酸芯片的制作是基于DNA 序列已知的基础上，而cDNA 片段可以来自序列未知的cDNA 克隆、EST 克隆，隐含的基因组克隆，或已知的基因组序列的扩增ORFs [24]。因此，基因表达芯片技术是一种高通量的对两种组织或细胞基因表达进行检测和分析的方法。该方法并且克服了核酸杂交技术的操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等问题[19]。Whitham等[9][25]通过使用微阵列技术，对不同种RNA病毒对易感的拟南芥基因表达的影响进行了研究，结果发现，不同种RNA病毒在易感植物宿主中诱发相同的反应，此研究有利于深入理解RNA病毒致病机理。在遗传上有显著差异的植物病原菌Xylellafastidiosa（Xf）的菌株导致了许多种植物病害，在全世界造成了巨大的经济损失。Nunes 等[10]以Xf 9a5c 菌株（导致柑橘花斑缺绿症）的基因组为参照，使用以微阵列技术为基础的方法，比较了12 个Xf 分离菌株，并对菌株间的基因组组成差异进行全面的评价。定量RT-PCR技术是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种检测特定基因表达量的技术，可以根据PCR扩增产物的量确定目的基因的表达水平[26]。包括相对定量RT-PCR，竞争性定量RT-PCR、比较定量RT-PCR 和实时定量RT-PCR[27]。朱建裕等[28]根据番茄环斑病毒（ToRSV）各株系RNAⅠ聚合酶基因的保守序列，设计并合成1对引物和1条Taqman荧光探针，建立了对ToRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。Chang JH等[11]根据番茄Pto基因家族的序列，设计特异性引物，应用RT-PCR技术，验证了Pto基因家族成员在抗感病番茄中的表达情况，结果发现Pto基因家族成员LescFen、Lescpth2和Lescpth5在感病番茄Rio Grande 76S中表达，Pto、Fen、Lpimpth2和Lpimpth5在抗病番茄Rio Grande 76R中表达。Gene calling是Shimkets等[12]人于1999年提出的，该技术受专利保护（USPYO5871697和USPYO5972693）。主要分为三步：①限制内切酶双酶切②加接头③PCR扩增，并对每个片段回收测序，测序结果数据库比对。具体步骤如下：合成双链cDNA，限制内切酶双酶切，对酶切产物加接头，然后用接头特异性的引物进行PCR扩增，引物分别用生物素和FAM标记，扩增产物毛细管电泳分离，并对每个片段回收测序，测序结果数据库比对。它可以对同一位点的基因表达种类和表达丰度进行分析[29]。此技术的应用有以下几个方面：①确定新的、稀少的表达基因；②当植物受到病原物侵袭时，可以快速检测到特异表达的基因；③可以利用比较基因组学比较种间基因差异，从而确定基因功能；④可以敏感地确定基因表达的微量变化等。另外，还有一些基因表达研究方法，如差异杂交，但仅适用于基因组基因组复杂程度较低的基因组，如酵母；S1核酸酶保护分析法间接的检测mRNA，适用于基因调控方面的研究，但是费时费力费用高；噬菌斑原位杂交可以分离cDNA中的目的基因，但费用较高；基因表达指纹技术，它采用酶切代替了PCR扩增，所获结果含有一定的编码信息，但是仅能得到高表达的基因，并且受电泳技术限制。在植物病理学研究领域，基因表达分析技术已经广泛的应用于病原菌的检测、转基因植物的检测、植物病原物互作机理的研究以及植物抗病信号转导研究等方面，使植物病理学研究者根据不同时期基因表达的变化，揭示植物抗感病机理、防治病虫害的发生以及选育植物抗病品种。虽然目前还有一些问题需要解决，但是相信随着各种基因表达研究方法的不断完善和改进，在植物病理学研究上将会有越来越广泛的应用。

苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）主要侵染苹果和梨，且分布范围十分广泛，可导致其产量明显下降和品质改变。本研究从湖北省农业科学院果茶蚕桑研究所国家砂梨资源圃采集砂梨样品52份，采用试管捕捉反转录-聚合酶链式反应（TC-RT-PCR）对这些样品中的苹果茎痘病毒进行了检测，其中33份样品的ASPV检测结果为阳性，带病毒率为63.5%。取RT-PCR检测为阳性的13个样品，在温室汁液摩擦接种草本指示植物西方烟，对该病毒的生物学特性进行了分析，大部分样品的病毒分离物在西方烟叶片上表现褪绿斑点或褪绿斑、坏死斑或坏死线或网状褪绿纹。从上述样品中选取5个分离物，接种不同的草本鉴别寄主植物，以明确其寄主范围。5个分离物在昆诺藜、心叶烟、本氏烟和克利夫兰烟上均产生明显的症状，但分离物间在症状出现时间和症状类型上存在一定的差异。在昆诺藜上症状表现最早，本氏烟和克里夫兰烟次之，心叶烟最晚。5个分离物在昆诺藜上均产生褪绿斑或斑点；在心叶烟主要产生褪绿斑；在本氏烟上主要产生褪绿斑点；在克里夫兰烟上只有个别分离物在叶片上产生边缘浅黄色，中间绿色的环斑；在千日红叶片上有不规则的凹陷的白斑；在苋色藜上没有明显症状。而心叶烟和苋色藜的ASPV检测结果为阴性，其他草本植物的ASPV检测结果为阳性。以上结果表明，ASPV可以侵染昆诺藜、本氏烟、克利夫兰烟和千日红。取症状表现明显的两个分离物进行了致死温度的测定，接种后观察症状表现发现两个分离物在处理55℃时仍表现症状，而在处理58℃和高于58℃的温度时都不表现症状，可以初步推测该病毒的致死温度为58℃。

黄皮原产于我国华南，在我国至少已有1500年的栽培历史，目前主要分布于广东、广西、福建、海南、台湾、四川、云南等地。越南、印度、泰国、马来西亚以及美国的佛罗里达州等有零星栽种。黄皮属于芸香科黄皮属植物，与柑橘同科，过去一直认为黄皮不会感染黄龙病病原。2006年8月，作者在广东罗定索龙镇柑橘园附近发现有些黄皮的叶片变黄，而且黄化的叶片一般从植株的顶端开始，逐渐向下扩展直至中部，这与柑橘黄龙病的黄化症状及发病规律很相似，那么黄皮的黄化症状是不是由黄龙病病原（Candidatus Liberobacter spp.）所引致的呢？黄皮是芸香科植物，同时也是柑橘木虱的寄主植物，究竟黄皮是否会发生黄龙病？其病原与柑橘黄龙病病原有何异同？值得进一步的探讨和研究。本研究从田间采集叶脉表现黄化症状的黄皮叶片，用CTAB法提取叶脉组织DNA。以α亚纲细菌的通用引物27F/1500R为外套引物，取2μl待测黄皮样品进行第一轮的PCR扩增，用已感染了柑橘黄龙病的病叶材料提取的DNA为阳性对照，健康黄皮材料提取的DNA模板为阴性对照，第一轮的PCR先进行10个循环；再以OI1/OI2c为内嵌引物，取第一轮扩增的2μl PCR为模板，在内嵌引物的引导下进行第二轮Nested-PCR扩增。通过Nested-PCR的扩增，在表现黄化症状的2个黄皮样品中则有1160bp的特异条带扩增，初步证明在表现黄化症状的黄皮样品中含有黄龙病病原。XbalⅠ酶切显示，该片段可被切成大小分别约为640bp和520bp的两个片段，初步证明黄龙病病原为亚洲种（Candidatus Liberobacter asiaticus）。扩增产物经纯化，与pMD18-TVector连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH 5α，筛选克隆重组子。对PCR产物进行测序及序列分析，结果表明黄皮黄龙病病原16SrDNA片段序列与柑橘黄龙病亚洲种16SrDNA片段序列的同源率为：98.3%～99.6%；与非洲种16SrDNA片段序列的同源率为96.8%；与美洲种16SrDNA片段序列的同源率为94.1%～94.6%；与非洲种亚种的16SrDNA片段序列的同源率94.5%。而与其他的根瘤菌、难培养菌和另外的α亚纲细菌的同源率都在87%～89%之间。因此，认为黄皮叶脉黄化的症状是由黄龙病病原引致的，称之为黄皮黄龙病，而且该黄皮黄龙病病原属于柑橘黄龙病病原亚洲种中的一个成员。系统进化树分析显示，黄皮黄龙病病原与中国柑橘黄龙病病原亲缘关系最近，推测是直可能来自柑橘黄龙病病原。过去人们对黄皮黄龙病关注较少，本研究从分子水平上证实了黄皮确实会感染黄龙病，建议今后在黄皮生产上应重视黄龙病的问题。但由于黄皮植株内的黄龙病病原含菌量却要比柑橘植株体内的要低得多，而且黄皮也较少表现柑橘黄龙病的典型的斑驳症状，这是否和黄皮的生理特性或者是其体内的某种物质有关，值得深入研究和探讨。

桑叶是家蚕的唯一饲料，桑树是蚕丝产业的物质基础。桑树生长在各种不同气候和地貌的生态环境，桑树萎缩病是蚕桑生产最严重的病害之一，主要有黄化型、萎缩型和花叶型3种类型，分布于中国、日本、韩国、格鲁吉亚、越南等蚕桑生产国，特别是中国和日本受害最为严重。桑树萎缩病在我国主要蚕桑区江浙、湖广及北方的山东、陕西等省均有分布，对蚕桑生产造成严重甚至毁灭性的危害，且防治比较困难。本研究对山东省发生的症状为萎缩型的桑萎缩病，采用PCR技术对其16S rDNA、延伸因子和核糖体蛋白基因片段进行扩增和直接测序，并且与已知的植原体各组中代表的植原体序列进行同源性比较，确定了该分离物的亚组分类地位。现将研究结果报道如下。表现萎缩型症状的发病桑树材料采自山东省宁阳市。克隆载体pMD18-T、PCR产物回收试剂盒、限制性内切酶及其他酶类等分子生物学试剂产品均购自TaKaRa公司。提取方法参照漆艳香等[1]的方法进行，总DNA于-20℃保存备用。植原体16S rDNA基因扩增采用Lee等[2]报道的通用引物R16mF2/R16mR1，植原体延伸因子基因的引物对fTufu/rTufu序列及核糖体蛋白（rp）基因的引物对rpF1/rpR1序列分别根据Schneider等[3]和Lim等[4]文献设计合成（Table 1）。以提取得病组织总DNA为模板进行PCR扩增。NamePrImersequenceTm(℃)ReferencesR16mF25′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′60[3]R16mR15′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′60[3]fTufu5′-CCTGAAGAAAGAGAACGTGG-3′50[4]rTufu5′-CGCAAATAGAATTGAGGACG-3′50[4]rpF15′-GGACATAAGTTAGGTGAATTT-3′55[5]rpR15′-ACGATATTTAGTTCTTTTTGG-3′55[5]Table 1 Primers used in this research to amplify three genePCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR纯化试剂盒进行纯化回收。PCR产物回收后与pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取筛选平板上的白色菌落培养，提取质粒，经PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。将所得DNA 序列输入GenBank进行Blast检索，采用DNAMAN和MEGA3.1软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录的相应基因的核苷酸序列进行比对分析，并构建系统进化树。以带有桑萎缩病原（Mulberry dwarf-Ningyang，MDNY）的发病桑树病组织总DNA为模板，16S rDNA引物经直接PCR扩增，得到长度为1.5kb的片段，延伸因子基因引物经PCR扩增，得到长度为0.8kb的片段，PCR扩增核糖体蛋白基因，得到长度为1.2kb的片段，与预期的结果一致，表明该病组织中存在植原体。对含有目标外源片断的重组质粒进行序列测定，扩增得到16S rDNA基因片断为1431bp；延伸因子基因片断为842bp，共编码280个氨基酸；核糖体蛋白基因片断为1249bp，DNAMAN软件分析表明该序列包括部分rps19和全部rp122和rps3基因。将MDNY的16S rDNA序列与GenBank中22个植原体分离物16S rDNA的核苷酸序列进行比对和构建系统进化树，该分离物与植原体的16S rI组处于同一个分支，与16S rI-B和16S rI-D亚组同源性最高。该分离物MDNY的延伸因子基因序列与GenBank中植原体16S rI组的7个亚组分离物延伸因子基因的核苷酸序列进行比对和构建系统进化树（Figure 1）。从系统进化树中可以看出，该分离物MDNY与16S rI-B和16S rI-D亚组处于同一分支，同源性最高，与16S rDNA的结果一致。Figure 1 Phylogenetic tree of MDNY based on the elongation factor gene sequences using neighbor-joining in MEGA3.1该分离物MDNY的核糖体蛋白基因（rp）序列与GenBank中植原体16S rI组的6个亚组分离物核糖体蛋白基因的核苷酸序列进行比对并构建系统发育树（Figure 2），从系统进化树中可以看出，该分离物与16S rI-D 的Paulownia witches-broom处于同一分支，同源性最高，确定了该分离物的亚组分类地位。Figure 2 Phylogenetic tree of MDNY based on the rIbosomal protein gene sequences using neighbor-joining in MEGA3.1夏志松等对桑黄化性萎缩病病原体16S rRNA基因序列进行了分析[5]，而刘清神等对广州桑萎缩病植原体进行检测时确定所检测的桑树植原体属于16S rI组[6]，没有确定桑萎缩植原体的亚组分类地位。本研究对分离物MDNY的16S rDNA和延伸因子基因构建系统发育树，确定该分离物与16S rI-B和16S rI-D的同源性最高。通过核糖体蛋白基因构建系统发育树表明该分离物MDNY属于16S rI-D亚组，进一步明确了其亚组分类地位。20世纪80年代至今，由于分子生物学技术，特别是分子克隆和PCR技术的应用大大加快了包括植原体在内的细菌系统学研究进展。目前植原体的分类16S rDNA是一种非常有效的手段，但对于16S rDNA类群内的进一步划分，用16S rDNA类群作为分类标准显得过于保守，延伸因子和核蛋白基因序列可以作为系统学研究的依据。Schneider等[7]对STOL类群和AY类群的16S rRNA和延伸因子基因进行序列分析，利用延伸因子基因比16SrRNA序列建立的遗传距离要远。Lee等[8]对植原体各亚组的16S rRNA和核糖体蛋白基因进行了分析，证明16S rRNA和核糖体蛋白基因序列分析可以作为植原体鉴定和分类的依据。本试验以16S rDNA基因，延伸因子基因及核糖体蛋白基因作为分类依据，在亚组水平明确了桑树萎缩病的分类地位，为今后研究桑树萎缩病植原体的来源、进化关系及其致病的分子机理提供了理论依据。

1.利用柑橘溃疡病菌细胞悬浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右。提取小鼠脾细胞mRNA，构建的单链抗体文库重链DNA大小为350bp左右，轻链为650bp左右，经linker（Gly3Ser）4连接后单链抗体DNA大小为1.2kb左右。将单链抗体文库DNA克隆到大肠杆菌JM109中，随机挑选了9个克隆子测序表明，9条单链抗体序列都是开放阅读框，其重链分别属于VH1、VH2、VH3基因家簇，轻链属于VKⅠ、VKⅢ、VKⅣ亚基因家簇。每个单链抗体的互补决定区（CDRs）都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。2.采用核糖体展示技术对构建单链抗体文库进行了进化和富集。结果显示第一轮核糖体展示后回收的mRNA量非常少，分光光度计已测不出其浓度，反转录RCR后，扩增得到的条带非常弱，说明在原始未筛选的抗体文库中，能与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖作用的单链抗体数量较少。经过三轮筛选后，得到的mRNA量逐渐增多，经RT-PCR后，产生了比较亮的扩增条带。说明在核糖体展示过程中，抗原阳性的单链抗体得到了富集。3.将未经过核糖体展示的原始单链抗体文库DNA和经过三轮展示的单链抗体文库DNA与噬菌体表达载体pCANTAB5E相连接后，转入大肠杆菌TG1中小量表达，表达后用间接ELISA测定单链抗体与抗原的结合活性。结果表明：从未经过筛选的原始单链抗体文库中随机挑取的60个克隆子表达产物与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖几乎没有结合能力；而从经过三轮展示后的单链抗体文库中挑取的60个克隆子中有30%与柑橘溃疡病菌O-特异性脂多糖有较好的结合能力。从三轮展示后的单链抗体文库中共挑取了180个克隆子，用间接ELISA法初筛到60株抗原阳性的单链抗体；然后用生物分子相互作用技术（biosensor，biacore）对筛选的抗原阳性的单链抗体进行了复筛，筛选了3株高亲和力的单链抗体（GX13、GX44和GX95）以用于下一步的表达鉴定。4.将筛选的高亲和力抗原阳性的克隆子从大肠杆菌TG1中转入高表达菌株HB2151中进行可溶性表达。单链抗体表达后，其表达产物主要集中于细胞周质提取物中，具有抗体活性。将浓缩的周质提取物进行SDS-PAGE电泳，显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE电泳显示，在32 kDa处有单一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白，将表达产物进行了Western blot 杂交，结果显示，与纯化后的电泳结果一致，在32 kDa处有单一的条带产生，说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。5.将筛选的抗原阳性单链抗体进行了特性研究。单链抗体（GX95、GX44、GX13）特异性强、亲和力高。其与柑橘溃疡病菌近源种Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xooc）；Xanthomonas campestris pv.campestri（Xcc）；Xanthomonas oryzae pv.oryzicola（Xoc）；及从柑橘叶片上分离的10种腐生黄单孢菌及Bacillus subtilis；E.coli 都没有交叉反应。Biacore 分析其亲和力表明，单链抗体GX95、GX44和GX13的亲和常数分别为1.98×1010 M-1、1.89×1010 M-1、3.43×1010 M-1。6.对筛选的单链抗体进行了测序。用DNAplot 软件分析单链抗体序列。结果表明：单链抗体 GX44 和GX13重链分别属于VH1基因家簇，GX95 重链属于VH3基因家簇；GX44和GX13轻链属于Vk IV亚基因家簇，GX95轻链属于Vk III亚基因家簇。用Vector NTI软件对筛选的单链抗体的序列同源性进行了分析，表明GX44 和GX13重链有89.67%的同源性，GX95和GX13具有92.53%的同源性。

美国白蛾周氏啮小蜂Chouioia cunea，属膜翅目Hymenoptera小蜂总科Chalcidoidea姬小蜂科Eulophidae啮小蜂亚科Tetrastichinae周氏啮小蜂属Chouioia，是杨忠歧等在1985年调查美国白蛾天敌昆虫时发现，并于1989年记述发表的一个新属新种。成虫 雌成虫体长1.1～1.5mm。红褐色稍带光泽，但头部、前胸及腹部色深；触角各节褐黄色；上额、单眼褐红色；3对足及下额、下唇复合体均为污黄色。头部正面观宽大于高（24：19），触角窝中部位于复眼下缘的连线上。前胸背板后缘有1排鬃毛，其他部分也生有较密的黑色短毛。中胸背片中叶及侧叶上的刚毛较密，但三角片上无毛。中胸小盾片略呈八边形，有比较明显的网状刻纹，在中部处刻纹明显较密且小，似乎形成1纵线。前翅长为宽的2倍，翅面被毛。3对足的腿节外方、胫节及跗节上生有密的刚毛，这些刚毛比雄性的短。雄成虫体长1.4mm左右，近黑色略带光泽，胸腹节色较淡，腹柄节、腹部第1节基部为淡黄褐色，触角及2分裂的唇基片黄褐色，足除基节色同触角外，其余各节均为污黄色。头部正面观宽显著大于高（22：14），在两触角窝之间的脸部的倒“V”字形缺口两侧各着生相向生长的刚毛5根；2唇基裂片外侧、颜面端部与上颚前端部形成的半圆形凹入部处的缘部生有很密的刷状毛。腹部背观卵圆形，背面及腹面均生有密毛，宽度与长度都比胸部显著为小。卵 初产时白色，半透明，牡蛎形，长0.054～0.065mm，大的一端宽0.021～0.033mm。幼虫 蛆形，无头无足，自由生活于寄主蛹内。蛹 蛹长1.2～1.7mm，体白色，腹部收缩，体色逐渐由白色变为浅黄色，腹部微呈黑色。周氏啮小蜂一年可发生4～7代。以老熟幼虫在美国白蛾蛹中越冬，翌年4月下旬5月初成蜂羽化。周氏啮小蜂发育起点温度为6.14℃，有效积温为（365.12±15.56）日·度。在温度为30℃，相对湿度为85%时，一世代发育时间为15.7天。周氏啮小蜂雌成虫在羽化后的当天即可产卵。既可咬破美国白蛾蛹体外的薄茧将卵产于蛹体上，也可找到美国白蛾的老熟幼虫，爬附于幼虫体上，用产卵器刺蜇寄主，注入毒液，促使其提前化蛹。化蛹时将雌蜂也包在茧内，一旦寄主化蛹完成，雌蜂即开始产卵，产卵时间可长达6～10小时。卵产于寄主体内的组织中，一头雌蜂最多能产卵680粒。产卵后2～3天，孵化为幼虫。幼虫以寄主的血淋巴器官组织为食。经7～8天后，幼虫开始化蛹。周氏啮小蜂的蛹为裸蛹，蛹期约5～6天。雌蜂在羽化后12～24小时即可交配，1头雄蜂可和多头雌蜂交配，雌蜂一生只交配1次，无重复交配现象。待一个寄主蛹内所有的雌蜂均与雄蜂交配后，咬开一不规则的圆孔爬出寄主体外。雌成虫在饥饿条件下可存活8天以上。人工繁育周氏啮小蜂的主要设施有：寄主冷藏库、成品蜂冷藏库、接种室、寄生暗室、培养室、暖蜂室、选蜂室、贮物室，此外，还应有办公室、实验室等。主要设备有：空调、冰箱、冰柜、加湿器、操作台、恒温恒湿箱、消毒设备、解剖镜、显微镜、电脑、打印机等。常用工具有：接种箱、玻璃试管、削茧刀、镊子、剪刀、软毛刷、棉花、胶带、消毒药液等。周氏啮小蜂虽然在自然界中寄主的种类很多，不仅可寄生美国白蛾，还可寄生油松毛虫、赤松毛虫、天幕毛虫、榆毒蛾、舞毒蛾、侧柏毒蛾、杨雪毒蛾、银杏大蚕蛾、野蚕、柞蚕、亚洲玉米螟、菜粉蝶、卫茅巢蛾、国槐尺蛾、卫茅尺蛾、大袋蛾、杨扇舟蛾及桃剑纹夜蛾等多种昆虫的蛹，也可重寄生于寄生蝇的幼虫或蛹，但在大规模人工繁育生产中，以柞蚕蛹为寄主为好。主要是因为柞蚕蛹容易被周氏啮小蜂寄生、个体大、繁殖系数高，且资源丰富，成本低，易于获得，能终年大量供应。柞蚕蛹宜在入冬前大量准备，收购回的柞蚕蛹应进行低温贮藏，温度控制在-2～2℃。贮藏时，将茧装入竹筐或塑料筐中，交错摆放，不宜过密，保持通风，防止受热。寄主的健康状况是繁蜂成败的关键，接蜂时必须剔除死亡、感病及不健康的蛹，只选用健康的柞蚕蛹作为繁育寄主。接蜂前，将柞蚕茧外面的浮丝剥去，首先在带有茧蒂的一侧削开一口，观察蛹的颅顶板。若颅顶板发白、且色泽新鲜则为健康蛹，如果颅顶板发黄或色泽发污，则为死蛹或不健康蛹。然后，再于茧的另一端削开一口，并用刀尖挑出柞蚕化蛹时的蜕皮。削茧时应掌握好下刀的深度，避免削到蛹体，两端的开口为直径约1.5～1.8cm的圆形或椭圆形。削好的茧既可直接用于接蜂，也可放回冷藏室贮藏备用。人工繁育周氏啮小蜂所用的种蜂，主要采用人工野外采集获得。在冬季，到美国白蛾的老发生区，人工野外采集美国白蛾蛹，以获得自然寄生于美国白蛾蛹中的周氏啮小蜂。将采回的美国白蛾蛹放入指形管或矿泉水瓶中，视指形管及矿泉水瓶的大小，装入约1/3的美国白蛾蛹，用棉花或黑布将口封好，放在22～26℃的暗室内或培养箱中培养，约10～15天，便可从白蛾蛹中羽化出周氏啮小蜂。从野外采集的种蜂数量是有限的，大规模人工繁育时，可根据防治需要再进行1～2次扩繁，从扩繁的种蜂中淘汰弱蜂，选择体壮、个体大、活动能力强的蜂作为种蜂进行成品蜂繁育生产。将削好的茧蛹放入繁蜂箱中，摆放最多不超过2层，按1头柞蚕蛹接65～75头雌蜂的比例将周氏啮小蜂接入繁蜂箱中，及时用胶带将箱缝密封。接蜂后的繁蜂箱，放入恒温箱或暗室中，在暗光条件下，周氏啮小蜂在柞蚕蛹上产卵寄生。暗室的温度控制在23～25℃，相对湿度保持在50%～70%。36小时后，打开繁蜂箱，将繁蜂箱转入培养室中培养，培养室的温度控制在23～28℃，相对湿度保持在40%～60%。7～10天后，蛹体内的啮小蜂进入老龄幼虫期，这时便可进行被寄生柞蚕蛹的挑选。被寄生柞蚕蛹可通过颅顶板或蛹体腹部的节间处看到蛹体内寄生的小蜂幼虫。健康的柞蚕蛹，周氏啮小蜂寄生率可达90%以上，单蛹出蜂量在4000～8000头，平均5000头，最多的可达10000头以上。将被寄生的柞蚕蛹挑选出后，装入筐中，放入15℃左右的过渡室中2～3天后便可转放6～10℃的冰箱或冷藏室中贮藏，贮藏时间以不超过30天为宜。出蜂时间应与美国白蛾老熟幼虫期和化蛹初期吻合，放蜂防治时间确定后，应将冷藏的成品蜂提前10～15天取出，放在暖蜂室进行升温。暖蜂温度应逐渐升高，每2～3小时升高5℃，1天后温度控制在24～26℃，相对湿度保持在60%～70%，并应注意通风。出蜂前1～2天即可进行林间释放。在恒温条件下人工繁育周氏啮小蜂多代后，产生蜂种会产生退化，影响繁蜂质量和防治效果。蜂种退化现象表现为同一批蜂出现羽化不整齐、羽化率低、体型变小、飞翔能力弱、寿命短、群体雄蜂数显著增多。为了防止蜂种退化，应在人工繁殖5～6代后进行蜂种复壮。利用自然界的蜂种进行复壮是一个有效措施，由于其已有相当长一段时间的自然锻练，故生命力旺盛。每年繁育周氏啮小蜂的种蜂应来自于野外采集的美国白蛾越冬蛹。冬季在上年放蜂地点或美国白蛾老发生区大量采集美国白蛾蛹，将采集回的美国白蛾蛹放入培养室中培养出蜂，然后，收集培养出的周氏啮小蜂进行种蜂扩繁，根据当年的繁蜂计划数量，将种蜂扩繁2～3代。繁育用于防治的成品蜂时，应采用扩繁的种蜂进行接蜂，不得用繁育的成品蜂作种蜂，尽量减少蜂的代数，控制退化现象的发生。周氏啮小蜂可以爬附在美国白蛾的老熟幼虫体上刺蛰，促其提前化蛹，然后产卵于美国白蛾蛹中，也可在美国白蛾蛹期直接在蛹体上产卵寄生。因此，放蜂防治的最佳时期是美国白蛾化蛹初期。由于美国白蛾的发育常常很不整齐，化蛹期持续时间较长，因此，1个世代应放蜂2次，才能达到较好的防治效果。一次在首批美国白蛾老熟幼虫期或化蛹初期，第二次放蜂应在第一次放蜂7～10天进行。也可将不同发育期的周氏啮小蜂（相差3～7天）混合，一次性放蜂。在自然环境中，周氏啮小蜂一年可繁殖4～7代，因此，为提高放蜂效果，放蜂应尽量在美国白蛾的第1代和第2代进行，第3代美国白蛾蛹期，很快就进入冬季休眠期，放蜂的利用率较低。释放周氏啮小蜂应选择风和日丽的晴天进行，阴雨和大风天气放蜂效果差。放蜂时最好选择下午日落之前和日出之前，这一段时间气象因子较为稳定，无风，空气湿度较为适宜。如果放蜂量较大时，放蜂时间可选择在5：00～9：00时和17：00～20：00进行。炎热的中午时段，不适合放蜂作业。在美国白蛾发生的林中，如果树冠较低或树干上有细枝条，可将小细枝折断，将寄生有周氏啮小蜂的柞蚕茧蛹从削口处挂在树枝上即可。如果树冠较高或树干上没有细枝条，则可用大头针将茧蛹固定在树干上。根据美国白蛾的发生情况，可采用逐株放蜂，也可只在有美国白蛾发生的树上放蜂。一般情况下，1头周氏啮小蜂雌蜂可以寄生1头美国白蛾。如果将自然界中的多种不利因素考虑在内，放蜂量应适当加大。放蜂量可根据美国白蛾虫口密度的调查结果，按蜂虫比（3～5）：1的比例计算。每个网幕美国白蛾按300头幼虫计算，每个柞蚕蛹出蜂量按5000头计算。天敌防治不同于一般药物防治，周氏啮小蜂放蜂后，具有在自然环境中多次繁殖、多次寄生的作用，所以防治效果调查应在放蜂后的各代美国白蛾蛹期进行调查，并以一年内总的寄生率来评价放蜂防治效果。寄生率调查，在放蜂后10～12天便可进行。分别在放蜂区和未放蜂区采集美国白蛾蛹，调查寄生情况，并计算出寄生率和防治效果。放蜂寄生率（%）=被寄生蛹数/调查总蛹数×100放蜂防治效果（%）=（放蜂区寄生率-对照区寄生率）/（1-对照区寄生率）×100%周氏啮小蜂在自然界中可以寄生多种鳞翅目害虫的蛹，这些害虫的蛹期相互衔接，为周氏啮小蜂在自然界中的生存提供了非常有利的条件。我们释放周氏啮小蜂防治美国白蛾时，周氏啮小蜂不仅可以寄生美国白蛾的蛹，而且，在两代美国白蛾蛹期之间，小蜂可以在其他害虫的蛹上寄生，等到下一代美国白蛾蛹期时，又可转到美国白蛾的蛹上寄生，从而达到持续控制美国白蛾的效果。利用周氏啮小蜂进行生物防治，不仅能有效地控制美国白蛾的危害，而且对其他害虫也有很好的控制作用，收到“一虫多治”的效果。