植物的诱导抗病性，又称系统获得性抗性，是植物在一定的诱抗剂刺激下，对随后的病原菌侵染具有抵抗性的特征。植物诱抗剂又名激发子，一般将能够诱导寄主防卫反应的生物来源和非生物来源的物质统称为激发子。这些物质在很低浓度下即可被植物识别为信号物质，诱发植物自身的免疫系统，最终使植物获得抵御病害的能力。寡糖类激发子是人类研究的最早、最为充分的一类激发子，并且由于其具有良好的环境相容性，因此是很有发展潜力的生物农药。壳寡糖已经应用于生产，防治作物病害，但对其进行结构修饰的寡糖，其诱抗活性还不清楚。新的寡糖—褐藻酸钠寡糖诱抗活性也未见报道。本文研究了稀土络合的壳寡糖（壳寡糖-铈配合物）以及褐藻酸钠寡糖诱导烟草抗烟草花叶病毒，为其作为生物农药提供依据。1.1.1 供试药剂 壳寡糖-铈配合物、壳寡糖，由中国科学院大连化学物理研究所研制。褐藻酸钠寡糖，由中国农业科学院饲料所研制。1.1.2 供试植物 枯斑三生烟（Nicotiana tobacum L.SamSun NN）。1.1.3 供试毒源 烟草花叶病毒（TMV），本实验室保存于普通烟上。接种病毒汁液为每克含TMV的烟草病叶，加入5倍体积0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0），在研钵中研磨后纱布过滤。1.2.1 试验处理 供试药剂：对照药剂壳寡糖50μg/ml，喷雾。供试药剂壳寡糖-铈配合物浓度分别为1μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，喷雾；供试药剂褐藻酸钠寡糖浓度为25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，喷雾。1.2.2 试验方法 选取大小一致6～8叶期的烟草植株，叶面喷雾施药。24h后汁液摩擦接种TMV病毒。在病毒汁液中加入少量石英砂，用毛笔蘸取汁液摩接种。枯斑三生烟苗采用半叶法接种，每株接4片叶。接种后每天观察发病情况。待全面发病后，调查病斑数。重复3次。抑制率（%）=[（对照叶片病斑数-处理叶片病斑数）/对照叶片病斑数]×100%最初的试验结果表明（表1），壳寡糖-铈配合物对抑制烟草花叶病毒引起的枯斑有抑制作用。在1～100μg/ml的浓度范围里，25μg/ml的诱抗效果最好，抑制率为55%，但是略低于阳性对照壳寡糖50μg/ml，抑制率63.9%。处理斑点数抑制率（%）壳寡糖-铈配合物1μg/ml43±18c37.025μg/ml31±13b55.050μg/ml38±18cd44.0100μg/ml42±19c37.7壳寡糖50μg/ml24±14b63.9CK68±26a—表1 壳寡糖-铈配合物不同浓度喷施对烟草花叶病毒病的防效 （P由于1μg/ml的壳寡糖-铈配合物依然有诱抗活性，并且25μg/ml的诱抗活性较好，因此将取浓度10μg/ml的壳寡糖-铈配合物，进行诱抗活性的检测试验。结果表明（表2），浓度为10μg/ml的壳寡糖-铈配合物比25μg/ml具有更好的诱抗活性，抑制病毒产生枯斑的抑制率为67.4%。但是与25μg/ml没有显著性差异。因此，10～25μg/ml的壳寡糖-铈配合物具有良好的诱抗活性，说明壳寡糖与稀土的络合物可以在低于壳寡糖的使用浓度时，依然具有较高的诱抗活性。处理斑点数抑制率（%）壳寡糖-铈配合物10μg/ml43±17c67.425μg/ml57±13cd56.750μg/ml73±22d45.0100μg/ml107±27a18.9壳寡糖50μg/ml28±13b78.7CK132±46a—表2 壳寡糖-铈配合物不同浓度喷施对烟草花叶病毒病的防效 （P在褐藻酸钠诱导抗性的试验中，试验结果表明，在25～100μg/ml的浓度范围内，褐藻酸钠具有诱抗活性，可以显著抑制病毒引起的枯斑的产生。其中浓度为50μg/ml诱导抗性效果最好，抑制率为71.8%，25μg/ml的褐藻酸钠也有较高的诱抗活性，抑制率为67.4%，均略高于壳寡糖50μg/ml（抑制率64.1%）。处理斑点数抑制率（%）褐藻酸钠25μg/ml59±27bc67.450μg/ml51±21c71.8100μg/ml74±32b59.1壳寡糖50μg/ml65±26b64.1CK181±32a—表3 褐藻酸钠不同浓度喷施对烟草花叶病毒病的防效（P多糖类化合物在自然界中分布广泛，是生命物质的重要组成成分。它不仅能够控制细胞的分化、分裂，调节细胞的生长和衰老以及维持生命有机体的正常代谢，还能够调节动植物细胞免疫以及其间信息的传递。目前，多糖作为生物激发子用于抗植物病害研究比较多，其中已报道氨基寡糖素、毛头鬼伞多糖、硫酸化的葡聚糖以及脱氧半乳聚糖[1～4]等具有诱导烟草抗烟草花叶病毒的生物活性。褐藻胶是一种来源于褐藻细胞壁的水溶性酸性多糖，主要从海带、巨藻、马尾藻等褐藻中提取得到，具有独特的结构和生物活性。褐藻胶由α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸通过1，4糖苷键连接而成的直链多糖[5]。褐藻胶还有很强的抗病毒活性，如抑制TMV，抑制程度随着褐藻胶浓度的增加而增强，且随着褐藻胶中古罗糖醛酸含量的增加而增强。电镜分析表明，TMV在培养基中呈单一分散悬浮，加入褐藻胶后则形成团聚物。团聚物的形成阻止了TMV在被感染细胞表面的脱衣壳过程，而阻止了TMV的RNA穿过细胞膜，从而防止感染[6]。但由于其凝胶性强，不容易被吸收，在应用方面收到很大的限制，将其水解为寡糖后，水溶性好，利于吸收。因此本文研究褐藻酸钠水解为褐藻酸钠寡糖后的生物活性，以期在生产实践中具有更加广泛的应用。结果发现褐藻酸钠寡糖具有良好的诱抗活性，并且好于阳性对照壳寡糖，但是其具体机理还有待于进一步的研究。近几年研究发现，稀土离子，尤其是Ce，有较广泛的抑菌作用，而且有降解有机磷的能力。壳聚糖-铈配合物对黄瓜中的硫磷农药残留有一定的降解作用，其降解产物是氨基对硫磷，基本解除了毒性[7]。研究已经发现壳寡糖能够诱导烟草抗烟草花叶病毒，本文研究了壳寡糖-铈配合物是否依然保持具有诱导抗性的活性。结果表明，壳寡糖-铈配合物尽管诱抗效果不如壳寡糖明显，但仍然具有较高的诱抗活性，至于是否有降解有机硫磷的作用，需要进一步的研究。经过化学修饰的壳寡糖-铈配合物可以改变壳寡糖的理化特征，产生新的活性，这对于加强寡糖应用的广泛性和多功能性具有重要的价值。

Rice stripe(RSV)has been known to distribute in rice areas all over the world,and it is very hard virus,transmitted by insect vectors,small brown planthopper(SBPH),Laodelphax striatellus,Fallen.Once the rice is infested,there is still no very effective measures to control,even the chemicals.The chemicals'effect is not ideal and more or less they could cause some environmental risks,so there is the common opinion in the IPM system that the rice varieties having resistance to rice stripe is one of the basic and effective measures to control this disease.In 2006 and 2007 for finding the resistant rice varieties that could be used for large scale in the field,the evaluation and screening of rice varieties were conducted in Jiaxing,Zhejiang Province.In 2006,there were 40 varieties provided for the experiement,just like Chunjiang 050,Xiushui 63,Y1,Zheda 510,Tai 03126,HZ586 and so on,and Jia 991 was set to be the control.Similar to 2006 studies,in 2007,there were 20 varieties used in 2006,and newly introduced into 17 varieties,just like Leyou 2,Jiaheyou 261,Bing 04～123,Jiashao 3.The control was still Jia 991.In 2006,the experiment was conducted in the yard of Shuangqiao Academic of Agricultural Science,Xiuzhou,Jiaxing.Last year in this plot rice was planted,and in winter no crop was planted.The water and fertilizer condition was good.The rice was seeded in 2th June,and transplanted to the field in 1st July.Randomed blocking design,and the size of every plot is 30m2,with three replications.The field management was as usual,except for no chemicals use for controlling the SBPH and RSV.In 2007,the experimental field was chose to north suburb of Jiaxing,where last year the RSV occurred hard.The experimental field condition and design were familiar with 2006,and total 111plots.Investigated Methods In 2006,after 5d from 1st July when the rice were transplanted,the investigation was conducted every 5d in field,till the diseases was stable,at that time the total rice tiller and the diseased tiller amount were recorded.Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield(%)SSRP=0.05P=0.011Jiahe2156.03aA2Y25.33bB3Jiajing36485.24bB4Y33.9cC5Shaojing04-463.49dD6Jia991(CK)3.07eE7Yongjing04683.02efEF8Y62.88fgEFG9Tai04-42.83gFG10Xiushui032.73ghGH11Qianghu9142.73ghGH12Y102.59hiHI1336You7482.52ijHI14Xiushui092.51ijHI15ZH2512.42jkIJ16Xiushui1102.27klJK17Jingzhi202.27klJK18Y42.23lmJKL19Jia04-332.14lmnKLM20Jiahua12.11mnKLM21Xiushui632.04nLM22Jiahe2182nM23Zheda5101.99nM24Bing01-1131.74oN25R41011.69oN26Y51.59oN27Jingzhi270.94pO28Chunjiang0500.91pO29Chunjiang0510.91pO30Bing03-1230.88pO31Jiaheyou28880.87pO32Zheda5320.86pO33Y80.86pO34Y10.81pO35Ning04-450.45qP36Tai031260.44qP37HZ5860rR38Y70rR39Y90rR40JiaheyouTR0rRTable 1In 2007,after 15th May,when the seeds were seminated,the investigation was conducted periodically in seedling stage till 20th June,when the rice was transplanted,the total rice tiller and the diseased tiller amount were recorded.And in field,30th July,when the disease was stable,the same indexes were recorded.By the total rice tiller and the diseased tiller amount,the disease percentage could be got,and by DPS software the resistance of different rice varieties could be made with ANOVA method.From table 1,we could get that in 2006 the RSV occurred softly in the experimental field,the CK,Jia 991'disease percentage was just 3.07%.Shaonuo 04~46,Y3,Jiajing 3648,Y2,Jiahe 215's were higher than CK;but there were four varieties,Jiaheyou TR,Y9,Y7,HZ586,which no typical RSV was found.By ANOVA analysis,the resisstance of rice varieties were obviously different.Jiaheyou TR,Y9,Y7,HZ586,which no typical RSV was found,the resistance were the highest;the Yongjing 0468,Y6 and CK were in the same level and at P=0.01 there were no obvious difference;and Shaonuo 04～46,Y3,Jiajing 3648,Y2,Jiahe 215 resistance were weak.In 2007,in the field the RSV occurred seriously in the experimental field,the CK,Jia 991'disease percentage was 19.12%(Table 2).Disease percentage of Shi 1 and Yongjing 0468 were 27.8%and 25.65%,respectively;there were 16 varieties,for example Jia 991,the disease percentage were above 10%;and the disease percentage of HZ586,Chunjiang 051,Jiahe 218,Jiaheyou 555 and Y9 were below 2%.By ANOVA analysis,the resistance of these rice varieties were seriously different.Disease percentage of Shi 1 and Yongjing 0468 were obviously higher than CK,their resistance were weak;the disease percentage of HZ586,Chunjiang 051,Jiahe 218,Jiaheyou 555 and Y9 were far below from other variety,their resistance were high;and others resistance were in the middle level.In 2007,in the seedling field the disease percentage of Bing 04～132,Zheda532,Xiushui 09,Xiuishui 110 and Bing 05～15 were all above 5%;the disease percentage of was just 0.07%,and in the Chunjiang 051 there was no RSV found;Other varieties percentage of disease were in the middle of 5%and 0.07%(Table 2).Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield(%)SSRP=0.05P=0.01VarietiesDiseasepercentageintheseedlingfield(%)SSRP=0.05P=0.011Shi127.8aABing04-1325.68aA2Yongjing046825.65aAZheda5325.6aA3Bing04-0819.62bBXiushui095.39aAB4Jia991(CK)19.12bBXiushui335.24abAB5Xiushui11018.5bBXiushui1104.85abcABCTable 2 Evaluation of rice varieties resistance to RSV (Jiaxing, 2007)Num.VarietiesDiseasepercentageinthefield（%）SSRP=0.05P=0.01VarietiesDiseasepercentageintheseedlingfield（%）SSRP=0.05P=0.016Bing05-1517.83bBCShi14.34abcdABCD7Bing01-11317.76bcBCJiahua14.34abcdABCD8Y517.33bcBCYongjing04684.24abcdABCDE9Jiahua116.5bcdBCBing05-154.15abcdeABCDEF10Xiushui3316.4bcdBCY53.78abcdefABCDEFG11Ning04-4516.26bcdBCBing04-083.66abcdefgABCDEFGH12Bing04-13215.75bcdBCJia991（CK）2.9bcdefghABCDEFGHI13Zheda53215.69bcdBCY22.88bcdefghABCDEFGHI14Y215.18bcdBCDBing01-1132.81bcdefghiABCDEFGHI15Shi215.06bcdBCDNing04-452.77cdefghijABCDEFGHI16Xiushui0914.99bcdBCDY12.66cdefghijABCDEFGHI17Y112.96cdeBCDEQianghu1712.52cdefghijkABCDEFGHI18Qianghu17112defCDEBing05-1142.48cdefghijkABCDEFGHI19Bing03-019.22efgDEFShi22.26defghijkBCDEFGHI20Bing04-1138.25fghEFGBing03-012.14defghijkBCDEFGHI21Jiaheyou6127.18ghiEFGHBing04-1131.69efghijkCDEFGHI22Bing03-1235.76ghijFGHJiaheyou2611.39fghijkDEFGHI23Leyou25.42ghijFGHJiaheyou6121.23ghijkDEFGHI24Jiaheyou2615.23ghijFGHBing03-1231.11hijkDEFGHI25Jiaheyou16204.76ghijFGHY71hijkEFGHI26Shaonuo04-464.36hijFGHChunjiang0500.99hijkEFGHI27Jiashao34.3hijFGHJiahe2180.94hijkFGHI28Chunjiang0503.22ijFGHLeyou20.9hijkFGHI29Y73.18ijFGHJiaheyou62230.72hijkGHI30Jiaheyou62233.1ijFGHJiaheyou5550.7hijkGHI31台031262.97ijFGHJiaheyou16200.5hijkGHI32Bing05-1142.9ijFGHY90.38hijkHI33HZ5861.83jGHHZ5860.32ijkI34Chunjiang0511.81jGHShaonuo04-460.24jkI35Jiahe2181.78jGHJiashao30.24jkI36Jiaheyou5551.53jHTai031260.07kI37Y90.94jHChunjiang0510kI续表2By ANOVA analysis,the different resistance of these rice varieties also existed.the disease percentage of Bing 04～132,Zheda532 and Xiushui 09 were higher,and their resistance were weak;the disease percentage of six varieties,Chunjiang 051,Tai 03126,HZ586,Shaonuo 04～46,Jiashao 3 and Y9,were lower,and they had comparatively high resistance.Through the rice varieties screening for resistance to rice stripe virus(RSV)in the seedlingstage and in the field in Jiaxing,in 2006 and 2007,the difference of rice varieties resistance to RSV could be found,and the resistance trends between different developmental stage and different year kept in the same trends.Chunjiang 051,Y9,Jiahe218,Jiaheyou 555,Tai 03126 and Bing 03~123,and so on,had the high resistance to RSV.Though most of the results showed that the varieties resistance behave the same in different developmental stage and different year,we also should notice that few varieties did not obey this trends,for example,Shaonuo04～46,in 2006 in the field it showed very weak resistance,but in 2007 in the seedling field it showed high resistance.This perhaps tell us that just use the index of disease percentage is not enough,and at the same time we could ignore that there is still no very clear criterion to evaluate the varieties resistance to RSV.These factors could influence our evaluation.In 2006 the RSV occurred softly in the experimental field,the CK,Jia 991 disease percentage was just 3.07%,but in 2007 the CK,Jia 991's disease percentage was 19.12%,far higher than that in 2006.That is because in 2007 we chose the field where in year before the RSV occurred seriously,and advanced the seeding date and transplanted date accordingly,which the two steps could make the optimal RSV occurring conditions.On other hands,in the same cultivated condition,the disease percentage different varieties could behave 10-folder difference,it could show us clearly that the varieties resistance could exert important role in the RSV IPM system.Research was funded by a grant from Zhejiang province Science and Technology Bureau.

中二软占是广东省农业科学院水稻所以粳籼21为母本，长丝占为父本杂交育成的早、晚兼用常规优质稻品种，于2001年通过广东省农作物品种审定。中二软占的丰产性和适应性好，米质良好，但中感稻瘟病。作者等将中二软占品种的种子经密封后送到酒泉卫星发射基地（部分中二软占种子留在地面作为非诱变原种对照），于2003年11月3日随“中国返回式科学试验卫星”升空，经过18天的太空旅行，于11月21日返回地面。2004年早造将中二软占诱变和非诱变原种对照单株种植，采用稻瘟病菌株GD0193接种到3到3片半叶的种苗上，发病7天后调查，792株经过空间诱变的种苗，病级为0～3级的抗病植株有208株，占总数的26.3%；病级为4～5级的植株有368株，占46.5%；病级在6级以上的有216株，占27.3%；80株原种对照种苗的病级均在6级以上。试验结果表明，中二软占的种子经过返回式卫星搭载后，对稻瘟病产生抗性变异，其中抗性明显提高的占26.3%；抗性比原种提高（病级0～5级）的植株数占72.7%。对中二软占空间诱变SP2代材料的抗性分离规律进行研究。从空间诱变中二软占SP1中选取33株抗病和2株感病植株的种子作为SP2的接种材料，原种中二软占作对照，接种稻瘟病菌株采用GD0193菌株。空间诱变中二软占SP1的2个感病植株在SP2抗性没有产生分离，33个抗病植株在SP2抗性产生分离，而且各株系抗感分离的比例也不一样。对33个抗病SP2株系抗感分离的比例进行X2分析，结果表明有21个株系抗感分离比例符合理论比值3：1，说明这21个株系可能受一个位点的抗性基因控制；有8个株系抗感分离比例符合理论比值15：1，说明这8个株系可能受两个位点的抗性基因控制。另外，有4个株系抗感分离比例既不符合3：1也不符合15：1。表明这4个株系的遗传基础比较复杂。由于目前对水稻空间诱变的染色体变异的遗传机理还不是很清楚，诱变除了导致基因的位点突变以外，也可能导致染色体的缺失、重复、倒位、易位等畸变。这些畸变将影响水稻的性状，而且使其在SP2的基因的分离规律变得更复杂。从33个空间诱变中二软占抗病植株的SP3-SP4代株系中连续两造各筛选出5株农艺经济性状较好的单株，考种及抗病性鉴定结果表明，与原种中二软占比较，抗病性有不同程度的提高，而且穗长、总粒数、结实率、粒长、谷粒长宽比、千粒重等性状与原种中二软占的相比，也有不同程度的提高。将33个空间诱变中二软占抗病植株和1个感病植株的SP4代株系进行抗谱测定，采用38个不同致病型代表菌株接种结果，原种中二软占和空间诱变感病株系的抗谱分别为29.0%和34.2%，33个空间诱变抗病株系中，抗谱达到80%以上的诱变株系有32个，其中抗谱在90%以上的诱变株系有24个，抗谱在80%～90%间的诱变株系有8个。中二软占是优质但中感稻瘟病的品种，从其空间诱变后代中有望筛选出对稻瘟病抗性及农艺经济性状比原种好的株系，可为抗稻瘟病育种提供新材料及优良抗源。目前作者等正重点开展有关优质、抗病的中二软占诱变品系的抗性遗传基础分析、抗病基因标记定位、空间诱变抗性变异机理研究等。

正向（经典）遗传学是通过生物的表型来推测其遗传物质的组成、分布和传递规律等，而反向遗传学是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论和技术，通过核苷酸序列的定点突变、缺失和插入等创造突变体并研究突变所造成的表型效应。随着基因组测序技术、侵染性克隆的构建技术、定点突变技术和报告基因的使用等，反向遗传学技术在研究植物病毒基因功能、侵染过程和致病机理等方面的应用越来越广泛。本文报道了该技术在研究马铃薯Y病毒（PVY）HC-Pro和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）P22功能方面的部分结果。PVY HC-Pro基因由本实验室提供，SPCSV的有关基因由芬兰赫尔辛基大学Valkonen教授提供，PVX201质粒由Baulcombe教授提供。突变试剂盒（Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）购自STRATAGENE公司，大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存，PCR突变引物由赛百盛公司合成。Figure 1 Symptoms of Nicotiana benthamiana plants inoculated with different constructs based on PVX 201将SPCSV P22、P28和RNaseIII等基因克隆到PVX201载体上，根据接种后出现的症状判断哪个基因能增强PVX对本氏烟的致病力。将PVY HC-Pro克隆到PVX201载体上，针对HC-Pro的KITC和IGN等位点设计合适的突变引物，参考突变试剂盒（Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）说明进行突变。通过测序证实所得突变体的准确性。大量提取法提取质粒PVX201、PVXHC或相应的突变体，摩擦法接种本氏烟（Nicotiana benthamiana），观察所致症状的差别。PVX201载体在本氏烟上引起轻微的斑驳和褪绿花叶症状，但不引起植株的死亡。SPCSV P28和RNase III等基因连接到PVX201后对症状无影响，但P22能提高PVX对本氏烟的致病力，导致了接种植株的死亡，说明P22是致病性的增强子。携带P22的PVX（PVX-p22）首先在接种叶上引起坏死斑点。坏死斑点扩展后，沿着叶脉到达茎部，引起上部组织坏死，最终导致本氏烟整株枯死。RNA沉默抑制因子HC-Pro也能提高PVX对本氏烟的致病力。表达HC-Pro的PVX（PVX-HC）在接种后7天出现严重明脉和卷曲，10～14天时首先心叶出现坏死，随后整株萎蔫死亡。但在接种叶上没有坏死斑，看不到明显的扩展迹象。KITC是HC-Pro的一个重要基序，参与病毒的蚜虫传毒、协生和抑制RNA沉默等过程。我们在测定烟草脉带花叶病毒（TVBMV）全基因组序列时发现，TVBMV（YND分离物）HC-Pro KITC基序中的K变成了R，而且也有蚜虫传毒活性。我们把PVY HC-Pro的KITC突变成RITC后，再接种本氏烟，发现该突变仍能引起本氏烟植株的死亡。把K突变为A（突变体1，K52A）后，突变体也能引起本氏烟死亡，说明HC-Pro KITC基序中的K可能不参与和PVX的协生。但把KITC基序中的C缺失后（突变体2，C55Del）就不能引起植株死亡，说明KITC基序中的C对于协生作用是不可缺少的。对于HC-Pro其他突变体的功能分析正在进行中。

沃尔巴克氏体（Wolbachia）是自然界中分布非常广泛的胞内共生菌之一，近10余年的研究表明，这类共生菌广泛存在于各类昆虫体内，甚至估计16%的昆虫均含有该菌[1]。对来自33个不同寄主的38个不同Wolbachia株系的ftsZ基因（细胞周期基因）研究表明，Wolbachia 株系间存在着很大的差异，Wolbachia 株系分为A组群和B组群[2]。Zhou等在wsp（编码Wolbachia表面蛋白）基因序列分析的基础上，将沃尔巴克氏体细分为12个亚群（Subgroup），并设计了12个亚群wsp基因诊断的PCR扩增特异引物[2]。昆虫体内是否含有Wolbachia，早期多通过DAPI染色法（用非特异性的DNA-blinding荧光染料DAPI染色，然后在荧光显微镜下观察）[4]和电镜观察[5]来判断，但20世纪90年代以来则主要依赖于对其16S rDNA、23S rDNA、ftsZ 和wsp等基因进行PCR检测与序列分析，其中wsp基因是目前报道的Wolbachia基因中进化最快的基因而被广泛用于Wolbachia的PCR检测与分子鉴别[1，3，6，7]。沃尔巴克氏体通过卵的细胞质传播并参与多种调控其寄主生殖活动的机制，包括诱导孤雌生殖（Parthenogenesis inducing，PI）[8]、雌性化Feminzation）[9]和生殖不亲和[10]，因而它很有希望被用于许多虫媒传播的重大人类疾病的基因工程防治和生物防治。灰飞虱（Laodelphax striatellus Falln）广泛分布于东亚、东南亚、欧洲和北非等地，我国以长江中下游和华北地区发生较多。灰飞虱能取食或为害水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、稗草、李氏禾等多种禾本科植物，并且能传播多种病毒病，造成病害的普遍流行。因此，进行灰飞虱种群暴发成灾规律及其有效防治技术的研究，显得尤其重要和紧迫。本文采用PCR方法研究了灰飞虱体内Wolbachia的感染，以期为开辟控制灰飞虱暴发和阻断病毒病传播新途径提供依据。从河北省曲阳和容城小麦田采集灰飞虱成虫，保存在小麦苗上。每只灰飞虱为1个样本，放入离心管中冷冻，而后置于载玻片上，呈直线逐步滴1滴Ringer's solution（昆虫生理盐水），去头，放入装有预冷100μl STE 的管中，匀浆，10%SDS 5μl及蛋白酶K 2.5μl，55℃水浴1h，加酚50μl及50μl氯仿：异戊醇（24：1），剧烈震荡，12000r/min 离心5min。取上清，加入2倍体积无水乙醇及0.1体积3mol/L NaAc，-20℃沉淀过夜，离心，12000r/min。弃上清，加75%乙醇200μl洗涤2遍。55℃烘干，加入30μl无菌水溶解，-20℃冻存，待检。扩增wsp基因片段使用的引物[3]：wsp 81F(5'TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC3')wsp 691R(5'AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3').在20μl反应体积中进行PCR反应，反应体系为13.5μl ddH2O，2μl 10×Buffer，2μl 25 mmol/L MgCl2，0.5μl dNTPs（每种10mmol/L），0.5μl 20μmol/L的正向和反向引物及一个单位的Taq高温多聚酶。Taq plus及dNTP购自上海生工生物工程公司。PCR反应条件是：首先在94℃下变性3min，然后94℃下1min，55℃下1min，72℃下1min完成1个循环，共进行35次循环。72℃末轮聚合10min。反应结束后取PCR特异性扩增产物5μl，在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳（电压40V，50min，电泳缓冲液为0.5×TBE），用BioRad凝胶成像系统检测并拍照。选择有扩增产物的样品进行大量PCR扩增，采用PCR产物回收试剂盒（上海生工生物公司产品）回收PCR扩增产物交上海生工生物工程公司进行测序，利用BLAST工具（NCBI网站）进行DNA序列检索和同源性比较。采用wsp基因通用引物81F和691R对灰飞虱DNA样品进行PCR扩增，电泳检测结果表明从灰飞虱DNA样品中可扩增出600bp大小的wsp目的基因片段，证实河北曲阳和容城田间采集的灰飞虱种群有Wolbachia 的感染（图1）。河北曲阳和容城灰飞虱种群的沃尔巴克氏体感染率分别为85.6%和88.4%，而且雌雄个体感染率无差别。将扩增的wsp基因片段进行基因序列测定，结果表明，从所检测的样品中扩增出的Wolbachia的wsp基因片段长度为601～603bp。用NCBI网站提供的BLAST分析工具进行基因序列同源性分析，表明灰飞虱体内感染的Wolbachia wsp基因与Wolbachia pipientis 的wFur、wStri 2个品系的wsp基因的同源性为100%，与Wolbachia sp.的wJapo、wFur、wStri 3个品系的wsp基因的同源性也达到100%（表1）。图1 灰飞虱体内沃尔巴克氏体wsp基因片段的扩增Wolbachia品系同源性注册号宿主来源WolbachiapipientisisolatewFur100%AF481185.1白背飞虱Kittayapong等，2003WolbachiapipientisisolatewStri100%AF481175.1灰飞虱Kittayapong等，2003Wolbachiasp.Wstri100%AF020080.1灰飞虱Zhou等，1998Wolbachiasp.wJapo100%AB039283.1ElenchusjaponicusNoda等，2001Wolbachiasp.wFur100%AB039043.1白背飞虱Noda等，2001Wolbachiasp.Wstri100%AB039042.1灰飞虱Noda等，2001表1 灰飞虱感染Wolbachia的wsp基因序列的同源性Wolbachia是自然界分布较广的共生菌，在双翅目、膜翅目和鳞翅目等许多昆虫体内均有感染。甘波谊等以PCR方法检测了来自不同地域稻田的3种稻飞虱，发现灰飞虱、褐飞虱（Nilaparvata lugens）、白背飞虱（Sogatella furciera）均被Wolbachia所感染，对wsp的RFLP分析证实了这些飞虱为单一沃尔巴克氏体感染[11]。但不同地区灰飞虱体内沃尔巴克氏体的感染率不同，在我国形成了周边地区感染率高（如辽宁、北京、上海和云南），而内陆地区感染率低（如四川），或是未被感染（如宁夏）的格局[11]。在日本采集的9个灰飞虱种群被Wolbachia感染的比率随纬度降低而增加[12]。这些不同可能与不同地区的地形、气候、寄主条件及Wolbachia的传播效率等因素有关，其原因有待研究证实。本文研究结果表明，河北曲阳和容城灰飞虱种群沃尔巴克氏体感染率较高，与前人的报道一致。通过对基因序列的同源性分析表明，河北的2个灰飞虱种群感染的Wolbachia与来自白背飞虱的wFur品系、灰飞虱的wStri品系亲缘关系较近，同属于Wolbachia B大组Con组。这些表明灰飞虱可能会被同一组的Wolbachia感染。灰飞虱是多种病毒的传播介体，灰飞虱的暴发流行常造成玉米粗缩病、水稻条纹叶枯病等病毒病的严重流行。沃尔巴克氏体是灰飞虱的胞内共生菌，能够通过多种机制调控其寄主的生殖活动[13]，但是，近年灰飞虱种群暴发成灾与Wolbachia 感染的关系有待进一步研究证实。同时，沃尔巴克氏体影响灰飞虱传毒能力的作用及利用媒介昆虫—共生菌技术阻断病毒的传播将是今后研究的重点，对于开辟病毒病防治新途径具有重要的意义。

川成都植物病害是由植物—病原—环境三者在一定适宜条件下，引起植物体发病，构成对植物正常生长发育和新陈代谢的干扰与破坏，最终造成植物的生物产量和经济产量减产，品质降低，给人类的农业、林业生产造成重大损失。植物病害的病原物是指能寄生于植物体并导致侵染性病害发生的生物。植物病害分成菌物（真菌）性病害、细菌性病害、病毒类病害、线虫类病害以及其他因素引起的植物病害。植物细菌性病害是植物病害中发生为害较重、发病规律比较难以掌握、防治技术要求高、防治效果很难凑效的一类病害。植物病原细菌是属于原核生物中的一个生物类群，它与真核生物在细胞结构及组成成分方面存在着较大的差异，正是这种细胞结构和组分上的差异，导致了细菌性病害比真菌性病害更难以防治。植物细菌性病害中比较著名的病害有：水稻细菌性条斑病、水稻白叶枯病、白菜软腐病、番茄青枯病、玉米细菌性枯萎病、柑橘溃疡病、梨火疫病、马铃薯环腐病。还有近年来被国际柑橘病毒学家确认的柑橘黄龙病等，这些植物细菌性病害给我国农业、林业生产带来了巨大的影响和危害。本文将对植物细菌性病害做了以下6个方面的初步探讨。早在2000多年前我国《诗经》中已经将生物划分成了植物、动物和蕈类三大类。1593年李时珍在《本草纲目》中将生物分成了植物、动物和人类三大类。在近代科学发展史上，以林奈为代表的生物分类学家将生物分成两界（即动物界Animaliae和植物界Plantae），这两界系统被人类科技界沿用了200多年。16～18世纪，随着显微镜发明和细胞学说的建立，人类才发现了单细胞生物——细菌。对于细菌在生物进化过程中，专家们普遍认为：细菌的出现应该是在植物和动物出现之前就已经存在了。1969年魏泰克将生物界分成五界系统，即：（1）以细菌为主的原核生物界；（2）以单细胞原生动物和藻类为主的原生生物界；（3）多细胞生物中以光合作用制造营养的植物界；（4）以多细胞为主吸收营养的真菌界；（5）多细胞生物中以摄取食物为营养来源的动物界。1974年黎德勒认为：取消原生生物界，将生物化分成四界系统，即：原核生物界、真菌界、植物界和动物界。1977年我国科学家陈世骧提出了生物学界的三总界构成六界系统，即：无细胞总界——（病毒界）；原核生物总界——（细菌界、蓝藻界）；真核生物总界——（真菌界、植物界、动物界）。1988～1989年（Cavalier-Smith），将生物学界划分成：两个总界组成的八界系统，即：一、细菌总界：①真细菌界；②古细菌界；二、真核总界：③古菌界；④原生动物界；⑤植物界；⑥动物界；⑦真菌界；⑧藻界。到2003年，他取消了古细菌界和古菌界，改为二总界六界学说。许志刚教授在2005年正式提出三域七界的最新分类体系，即无细胞生物域的病毒界；原核生物域的细菌界；真核生物域的原生生物界、真菌界、藻物界、植物界和动物界。反映了当前人们的认识水平。从上述分类系统可以看出，细菌的分类始终处于原核生物界内，它与真核生物在细胞结构及其组成成分上存在着许多本质上的差异。原核生物是以单位膜为界的，细胞核质无核膜包围，呈原核状态。含肽聚糖的细胞壁有或无；核糖体在细胞质内70S。染色体的数目为1。细菌的质粒DNA游离于细胞质中。细菌都是单细胞生物，它们的细胞膜外都有一层主要由肽聚糖（革兰氏阳性细菌）或脂多糖（革兰氏阴性细菌）构成的坚韧细胞壁。真核生物：具有以单位膜为界的细胞器，细胞壁不含肽聚糖。细胞核有核膜包围，呈真核状态，核糖体80S，在细胞器内的核糖体70S。细胞内有内质网、高尔基体、溶酶体、叶绿体有或无、有微管系统。染色体中有组蛋白；有核仁；要发生有丝分裂；细胞器有DNA（如线粒体）；配子能够融合；DNA不单向转移形成部分二倍体。最典型的是真核生物具有真正的细胞核以及其他细胞器组成成分。核是细胞的控制中心，它由核膜包着与核外的细胞质分开。核膜内有核仁和核质。植物病理学家们长期以来将植物细菌性病原种与对寄主的致病性作为一个非常重要的因素，同时要依据病原细菌的生理生化性状和血清学性状等指标来综合确定植物病原细菌的种。在《伯杰氏细菌学手册》第七版出版时已经命名的植物病原细菌种有200多种。根据生物学命名中优先命名权不能侵犯的原则，确定每一个新种必须查阅大量文献，以避免同物异名的出现。在《伯杰氏细菌学手册》第八版中将植物病原细菌种由原来的200多种削减为几十种，以保证所有种都可以用生化试验来进行鉴定并尽量保证能在实验室条件下可以重复实验，使之更具有科学性和重复性。1994年，根据《伯杰氏细菌学手册》第九版的系统分类：将细菌分成了四大类35个群。2000年以后，《伯杰氏细菌学手册》第二版分五卷陆续出版发行，该版本的最新分类体系中将细菌界包括了16门、26组、27纲、62目、163科、814属，共计4727种。植物病原细菌属于细菌界中普罗特斯门、放线菌门和厚壁菌门。普罗特斯门细菌细胞壁主要由脂多糖组成，肽聚糖含量较少，因而革兰氏染色阴性。放线菌门细菌的细胞壁中肽聚糖含量高，革兰氏染色阳性。厚壁菌门中的病原生物包括植原体（Phytoplasma）和螺原体（Spiroplasma）。已经描述的引起植物病害的原核生物有28个属。植物细菌性病害的病原菌主要分成五大类别。第一类：黄单胞菌属（Xanthomonas）。黄单胞菌属是细菌中的特殊类群，目前文献中描述的黄单胞菌属的种几乎都是植物病原细菌。它可以为害120多种单子叶植物和270多种双子叶植物。黄单胞菌引起许多重要植物病害，比较典型的病害有：（1）甘蓝黑腐黄单胞菌（X.campestris pv.campestris）；（2）水稻白叶枯病（X.oryzae pv.oryzae）；（3）水稻细菌性条斑病（X.oryzae pv.oryzicda）；（4）柑橘溃疡病（X.campestris pv.citri）。由黄单胞菌属细菌引起的植物病害大多数症状为叶枯、坏死、萎蔫等症状。第二类：假单胞菌属（Pseudomonas）。假单胞菌属细菌大多数都是土壤、水、其他基质上的腐生菌，有些是植物病原细菌。它的生态适应性广，表型差异大，是一个非常异质的组群。丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）是重要的植物病原细菌，能为害多种植物。在《伯杰氏细菌学手册》第九版中正式命名的植物病原细菌有7个种。第三类：欧文氏菌属（Erwinia）。欧氏菌属细菌是人类第一个发现的植物病原细菌。有史以来所发现的欧氏菌属细菌一部分是植物病原细菌，最常见的是各种植物的软腐病，也有萎蔫和坏死。典型的病害有：梨火疫病（E.amylovora）；玉米细菌性枯萎病（E.stewartii）；马铃薯和大白菜的软腐病等。由欧氏菌引起的细菌性软腐病在全世界均有发生分布。第四类：土壤杆菌属（Agrobacterium）。土壤杆菌属细菌是一类习居于土壤的细菌，在土壤中广泛的分布。常见的致病性细菌种有根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌。根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）能为害多种双子叶植物，在近土根茎部形成恶性肿癌。发根土壤杆菌（A.rhizogens），在侵染双子叶植物幼根后形成丛生的毛发状根群，称之为发根。第五类：棒形杆菌属（Clavibacter）。它是从棒状杆菌属（Corynebacterium）中分列出来的一个新属。国内发现的植物病原棒形杆菌属细菌中，最典型的病害有马铃薯环腐病菌（C.m.pv.sepeadonicum）在国内马铃薯产区均有分布。由于该病菌是以种薯传带的，所以在调运马铃薯种薯时必须要实施检疫。小麦蜜穗病菌（C.tritici）在国内华北冬麦区、山东、安徽、江苏、浙江、贵州等省已有发生。植物病原细菌从植物的气孔、皮孔、蜜腺等自然孔口以及伤口侵入寄主。植物细菌性病害主要见于高等被子植物和栽培植物上较多。植物病害的症状包括病状和病症两个方面。所谓病状：是指感病植物的外部特征，主要表现有：（1）变色：指整个植株、叶片或叶片部分变色。（2）坏死：指植物体局部细胞和组织的死亡。（3）腐烂：整个植物的组织和细胞被破坏和消解。（4）萎蔫：植物病害中的萎蔫是指植物的输导系统被病原物毒害或病组织的产物阻塞而造成不可逆转性的萎蔫。（5）畸形：感病植物组织和器官所发生的皱缩、卷曲、萎缩、丛枝、发根、肿瘤，花器和种子变态。所谓病症：是指病原物在病株发病部位上所表现的特征。主要表现有：（1）霉状物。（2）粉状物。（3）锈状物。（4）粒状物。（5）根状菌索。（6）菌脓。菌脓：是指发病部位产生的胶黏脓状物，干燥后形成白色的薄膜或黄褐色的胶粒。菌脓是细菌性病害在田间特有的病症。从多年田间病害症状诊断的实践环节看，植物细菌性病害田间症状诊断上着重注意几点：细菌性病害往往会出现局部坏死斑点，如柑橘溃疡病的病斑。腐烂：很多蔬菜类作物上出现的软腐病、马铃薯环腐病等。萎蔫：作物上出现的青枯病，全株性萎蔫。菌脓：如水稻细菌性条斑病病叶上出现的胶黏脓状物。细菌性病害往往不会出现整株变色、叶片上不会出现霉状物、粉状物、丛枝、萎缩等症状。细菌性病害会出现发根和肿瘤等症状。这个问题是一个非常复杂的问题，要回答好这个问题并非易事。从理论上探讨，所有植物病原细菌都可以通过种子传带。细菌附着在种子表面，也可以存活于种皮内，以及块茎组织内部。细菌在植物种子上一般存活1～2年。植物病原细菌一般产生胞外多糖，且一般具有鞭毛结构。因而，雨水的溅射和细菌自身在水中的游动可导致其传播。此外，随着灌溉水的流动，细菌可以在田块间传播。在20世纪60～70年代，水稻白叶枯病在四川省水稻产区流行蔓延，造成水稻产量严重减产，损失惨重。植物病原细菌可以通过苗木、接穗传播。嫁接工具、人为操作不当的行为均可以传播植物细菌性病害。柑橘溃疡病在我国柑橘主产省区均有不同程度地发生为害。狂风暴雨夹带雨滴是沿海岸线柑橘产区柑橘溃疡病蔓延猖獗的主要环境因素。通过媒介昆虫可以传带细菌性病害。柑橘黄龙病传毒主要媒介是柑橘木虱。要使柑橘黄龙病发生蔓延的几大因素是：一是要有柑橘黄龙病病树存在；二是要有传毒的媒介昆虫；三是要有感病的寄主。同时，昆虫的越冬寄主枳壳、九里香等存在为病菌的越冬和第二年的病菌的侵染循环创造了条件。如何掌握植物细菌性病害发病规律，作者认为应该注意以下几点：（1）植物的种子、苗木、接穗等一切繁殖材料均有可能携带植物细菌性病害的病原，并能在植物体表或表皮内较长时期的存活，是远距离传播植物细菌性病害的主要原因。（2）由于植物病原细菌的细胞有胞外多糖，在有水膜存在下可以加快细菌侵染速度，为害程度由点到片逐步加重。在雨季、大风、甚至飓风条件下加快了点片发生与为害的程度。（3）有灌溉水存在的条件下可以加快植物细菌性病害的流行蔓延，是大面积造成为害损失的主要诱因。（4）有媒介昆虫的发生、越冬寄主的存在，为植物细菌性病害的再次侵染循环奠定了基础和创造了条件。（5）嫁接工具、农事活动操作不当均可以造成寄主大量伤口，有利于病原细菌的侵入，导致田间植物细菌性病害近距离传播为害。（6）适宜的温湿度条件，加速了植物细菌性病害的侵染循环。根据植物细菌性病害发病的诱因和发病基本规律可以看出：种子、苗木可以带菌；细菌繁殖速度快、侵染途径多；远距离传播与近距离扩散相辅相成，加快了细菌性病害点、片发生，具有暴发成灾、损失严重的特点。植物细菌性病害很难防治，药剂防治效果很难奏效。四川省在防治水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等细菌性病害中都不是单一地采用药剂防治。药剂防治只能作为综合治理植物细菌性病害技术环节中的一个重要环节，特别是柑橘溃疡病防治技术中，国内外至今尚未见到仅仅依靠药剂防治来完全控制其为害蔓延的成功范例。柑橘黄龙病的综合治理更是如此。（1）建立无病虫种子、苗木繁殖基地，生产健康无检疫性病虫的种子苗木。（2）种子苗木调运前实施田间产地检疫和抽样实验室检验相结合，保证调出种子苗木是无病的。（3）调入地尽量集中成片种植，播种前进行种子消毒处理，有利于生产管理和病虫害综合治理。（4）加强田间病虫害预测预报，发现细菌性病害点、片发生时，及时拔除病株销毁，并用药剂对周围植株进行保护性防治。（5）严格对发病田块的肥水管理，防止有病田块流水串灌或漫灌。（6）对较大面积发生细菌性病害的发病区要及时隔离，防止上游流水继续向下游流传，造成更大面积的细菌性病害流行。同时对发病区要进行较大规模的药剂防治。（7）及时换种、加强轮作换茬，防止细菌性病害在田间菌量的不断积累和再次暴发成灾。（8）注意嫁接工具的消毒，防止农事活动中人为的传播感染。

猕猴桃果脯 （图8-1） 在制作过程中，技术要求比较高，要根据当地的具体情况采取具体措施，本书介绍的方法可为生产者提供参考。图8-1 猕猴桃果脯原料分选→清洗→去皮→切片→烫漂→糖渍→糖煮→干燥→整形→包装（1） 原料分选。选用八成半成熟的果实，果实要有一定的硬度，无病虫害、霉烂变质。（2） 清洗。用流动自来水将猕猴桃表面的泥沙及污物洗涤干净。（3） 去皮。用80～90℃的浓碱液浸泡30～60秒去皮，然后迅速用自来水冲洗掉果实上的残留皮屑和碱液，并用1%的盐酸溶液浸泡以中和残留的碱液。（4） 切片。将猕猴桃果实横切成厚度为5～6毫米的薄片，并浸入1%～2%的盐水中，以抑制氧化酶的活性。（5） 烫漂。将猕猴桃片在沸水中烫漂2分钟左右，以杀灭氧化酶活性，并迅速用自来水冷却。（6） 糖渍。沥干水分的猕猴桃片，用白砂糖糖渍20～24小时，砂糖用量为称猴桃片重的40%，砂糖在上、中、下层的分布比例为5 ∶ 3 ∶ 2。（7） 糖煮。取出糖渍好的猕猴桃片，沥干糖液，在糖液内加入砂糖，使含糖量达到65%左右，煮沸后加入糖渍过的猕猴桃片，再次煮沸25～30分钟。当糖液含糖量达到70%～75%时，取出果片沥干糖液。（8） 干燥。将糖煮过的果片，放在竹筛网 （或不锈钢丝网） 上，在55℃左右的烘房内干燥24小时左右。（9） 整形包装。干燥后的果脯片需压平，然后用玻璃纸或聚乙烯薄膜包装。用猕猴桃果实制果酱的利用率高达90%以上，果酱营养丰富，甜酸适度，有良好的开胃生津效果，极受消费者欢迎。（1） 感官指标。色泽呈黄绿色或黄褐色，有光泽，均匀一致。口感具有猕猴桃酱所特有的风味，无焦煳味，无异味。形态为蒸制酱体呈胶黏状，带种子，保持部分果块，置于水面上允许徐徐流散，不得分泌汁液，无糖结晶。不允许有杂质存在。（2） 物理生化指标。每罐净重允许公差±3%，但每批平均不低于标明的净重。总糖量不低于57%（按转化糖计），可溶性固形物不低于65%（按折光计）。（3） 微生物指标。无致病病菌及因微生物作用而引起的腐败征象。（4） 罐型。旋口玻璃瓶或铁罐。选果→清洗、消毒→去皮→破碎→软化→加糖浓缩→装罐、封罐→杀菌→冷却→擦罐入库→包装→贮运（1） 原料选择。加工果酱的猕猴桃果实要求果心较小，种子较少，含有丰富的果胶物质和有机酸，果肉甜酸适度，芳香味浓，颜色一致，成熟良好。果肉颜色不同的果实，应分别进行加工。要剔除腐烂变质果、硬果及成熟过度果。（2） 原料清洗。先用1%的漂白粉溶液或0.1%的高锰酸钾溶液进行消毒处理，再用清水彻底清洗。（3） 去皮。可用人工法将果实切开，用勺子将果肉挖出；也可用化学去皮法，将10%～25%的氢氧化钠溶液煮沸，放入洗净的果实，浸泡1～2分钟，冲洗去皮以后再放入1%的盐酸溶液中，常温下处理30秒，立即用流水冲洗10分钟。（4） 打浆软化或破碎软化。①打浆软化是将果实去皮后，倒入打浆机中进行打浆。打浆机的筛板应根据留籽或去籽的加工要求进行选择。将果浆倒入夹层锅中，再加入75%的糖浆进行软化 （10～15分钟），这样可制成全泥状果酱。②破碎软化是将洗净去皮的果实，用破碎机破碎成小碎块，然后倒入夹层锅中加入糖液软化，这样可制成块状果酱。（5） 浓缩。浓缩包括常压浓缩和真空浓缩两种方法。常压浓缩是把果酱倒入夹层锅后，再加适量75%的糖液 （须先经过滤），然后加热，并不断搅拌，以便加速蒸发和避免发生焦糊。浓缩时蒸汽压力为245～294千帕，浓缩时间为30分钟左右。浓缩时间过长，易使果酱颜色变褐，凝胶能力降低，贮藏期蔗糖返沙。在有条件的厂中，可将原料用泵打入真空浓缩锅内，在减压低温条件下进行蒸发浓缩，能有效地避免养分的损失。为了提高果酱的质量，可添加适量的果胶，使色泽和风味有所提高。真空浓缩的配料为：果酱100千克、白糖100千克或75%的糖水135千克、真空浓缩锅的真空度约80千帕 （600毫米汞柱），浓缩到65%～66%（用折光计测） 出锅，再加热到100℃左右，以后保温在90℃以上。（6） 装罐。用经消毒的四旋瓶装酱，酱温不能低于86.5℃，趁热封罐，注意勿外溅污染瓶口。（7） 杀菌及冷却。玻璃瓶封口后应在100℃条件下立即杀菌20分钟，分段冷却，以防玻璃瓶炸裂。（8） 擦罐、入库。将杀菌后的玻璃瓶擦净入库。猕猴桃果汁是极受市场欢迎的保健饮料，用猕猴桃果汁还可以加工浓缩果汁、果酒、汽水、果冻、果晶等多种产品。（1） 感官指标。色泽呈黄绿色或浅黄色。口感具有猕猴桃汁特有的风味，酸甜适度，无异味。形态为汁液均匀混浊，静置后允许有沉淀，但摇动后仍呈均匀状态。不允许有杂质存在。（2） 物理生化指标。每罐净重为200克或250克，允许公差±3%，但每批平均不低于净重。可溶性固形物为11%～15%，总酸0.3%～1%（以柠檬酸计），原果汁含量不低于40%。（3） 微生物指标。无致病病菌及因微生物作用而引起的腐败征象。（4） 罐型。采用QB 221—1976马口铁罐型规格系列标准。选果→清洗、消毒→去皮→破碎、打浆→榨汁→过滤→调配→加热→装罐→封罐→杀菌→冷却→擦罐入库包装→贮运（1） 原料选择。要求果实成熟度达八九成，新鲜完好，色泽正常，无病虫果和烂果。（2） 原料清洗。先用1%漂白粉溶液或0.1%的高锰酸钾溶液进行消毒，清除虫卵及微生物，再用清水清洗几次。（3） 去皮。可用人工法将果实切开，用勺子将果肉挖出；也可用化学去皮法，将10%～25%的氢氧化钠溶液煮沸，放入洗净的果实，浸泡1～2分钟，冲洗去皮以后再放入1%的盐酸溶液中，常温下处理30秒，立即用流水冲洗10分钟。（4） 破碎、打浆。将去皮的果实在破碎机中破碎或在打浆机中打浆。（5） 榨汁。把破碎成浆的果实加热到60～65℃，放入榨汁机中榨汁 （立式压汁机），榨汁时如果在果浆中加入适量的果胶分解酶可使出汁率由55%提高到60%。（6） 过滤。在过滤机中过滤或用平板布过滤，把果汁中的残籽或果肉滤出。这时果汁混浊，若在低温下冷冻，吸取上清液便得到澄清果汁。若需制混浊果汁，则把滤出的混浊果汁在真空脱气罐中进行脱气，使果汁色泽不变，然后用高压均质机进行均质，使果汁中的细小颗粒进一步细碎，促使果汁溶出，使果胶与果汁亲和，保持果汁的混浊度。（7） 调配。按原果汁含量的40%加白砂糖配成可溶性固形物为35%以上的果汁。（8） 加热。将调配好的果汁通过灭菌器加热。（9） 装罐。当果汁温度在70～80℃时，应当迅速装入罐或瓶 （罐、瓶必须提前清洗干净和消毒）。（10） 封罐。趁热将罐封口，真空度要求46.7 千帕 （350毫米汞柱） 以上，要封口良好。（11） 杀菌及冷却。装罐密封后立即杀菌 8～15 分钟（100℃），杀菌后冷却到40℃时取出。（12） 擦罐、入库。冷却后将罐擦干净入库。原料选择→清洗→去皮→修整→预煮→装罐→排气→密封→杀菌→冷却→检验→贴标→成品（1） 原料选择与清洗处理。选用七八成熟、果实个体大小较均匀的中等果实为原料，剔除烂果、过大过小果、病虫果、机械伤及畸形果。品种以老皮绿肉为好，用清水清洗干净，晾干备用。（2） 去皮、修整。将清洗干净的果实投入煮沸的烧碱溶液（10%～15%） 中浸泡2～3分钟，待果皮由黄褐变黑并产生裂缝时，用笊篱捞出。戴上橡皮手套，用双手轻轻搓去果皮，然后置于清水中不断清洗，除去碱味。用不锈钢刀挖去花萼、果蒂，去除残余果皮及斑疤，并按色泽和大小分级。（3） 预煮。将去皮修整后的果肉放在沸水中预煮3～4 分钟，捞出后迅速冷却。（4） 糖水配制。65升清水加35千克白糖，加热煮沸后用绒布或4层纱布过滤。用柠檬酸调 pH 值为4，糖水温度保持在80℃以上。糖水随用随配，不得积压。（5） 装罐。选色泽一致、大小均匀的果块装罐，然后加入糖水，罐内留2～3毫米的顶隙，罐盖与胶圈须用100℃热水烫煮消毒 5 分钟。装罐后，放入排气箱内进行排气，蒸汽温度98～100℃，排气10～12分钟，至罐中心温度达到80℃以上时封盖。如无排气箱，也可用蒸锅代替。排气温度和排气时间要妥善掌握。封盖后立即杀菌，即5分钟内使杀菌锅内的温度上升到100℃，并在此条件下保持18分钟。猕猴桃果酒，是一种低度酒，一般酒精度为12°左右，较甜，具有猕猴桃特有的果香和醇香，是老少皆宜的产品。选果→清洗、消毒→破碎→主发酵→压榨分离→后发酵→陈酿→调配→过滤→装瓶→成品（1） 原料选择。原料需要充分成熟发软且有猕猴桃浓香味的果实，剔除腐烂变质、病虫果及未熟果。（2） 清洗。用清水洗去果实上的泥沙、虫卵及其他杂质。（3） 破碎。将洗净的果实在破碎机内破碎成浆状或糊状。（4） 主发酵。把已破碎的果浆，倒入或泵入经过消毒的发酵池或缸内，加入5%的酒母糖液，搅拌均匀，发酵温度维持在25～28℃，每天搅拌2次 （上、下午各1次），使发酵均匀。当残糖下降到1%时，即可进行压榨分离。（5） 压榨。主发酵结束后进行压榨，使皮渣与酒液分离。压榨后的皮渣，还可进行2次发酵，蒸馏白酒或称 “白兰地”。（6） 后发酵。酒液转入后发酵，当酒度达到12°时，再加入适量砂糖，在20～25℃条件下，进行30天左右的后发酵，之后可转入陈酿。（7） 陈酿。后发酵结束后酒液不清，不容易沉淀，此时可将酒液倒入池或缸中，调整酒度到16°左右，置于15～18℃的室温下进行陈酿，翌年2月进行倒池或倒缸，年底即可调配成成品酒。（8） 调配过滤。调配酒度可按12°～16°调配，经过滤后，要求酒液透明。（9） 装瓶。将酒装入已经消毒好的瓶中，装后立即压盖密封。（10） 包装成品。通过检查质量合格的猕猴桃酒，贴上商标，作为成品销售。

在建园前要根据柑橘(砂糖橘)的生物学特性，分析建园地的地形、气候、土壤、水源等环境条件，综合评价，因地制宜选择园地。园地选定后，应根据建园要求与当地自然条件，本着充分利用土地、光能、空间和便于经营管理的原则，进行全面的规划。规划的具体内容包括:作业小区的划分、道路设置、水土保持工程的设计、排灌系统的设置以及辅助建筑物的安排等。梯田是山地果园普遍采用的一种水土保持形式，是将坡地改造成台阶式平地，使种植面的坡度消失，从而防止雨水对种植面土壤的冲刷。同时，由于地面平整，耕作方便，保水保肥能力强，因而所栽植的柑橘(砂糖橘)生长良好，树势健壮(图2-1)。图2-1 水平梯田图2-2 鱼鳞坑坡度较大、地形复杂的山坡地，不适合修水平梯田和撩壕时，可以挖鱼鳞坑(图2-2)进行水土保持，或因一时劳力不足、资金紧缺等原因，不能及时修筑梯田的山坡，可先修鱼鳞坑，以后逐步修筑水平梯田。(1)定定植点。修筑时，先定基线，测好等高线，其方法与等高梯田相同。在等高线上，根据果树定植的行距来确定定植点。图2-3 撩壕(2)挖坑。以定植点为中心，从上部取土，修成外高内低半月形的小台面，大小为2～5平方米，使之一半在中轴线内、一半在中轴线外，台面的外缘用石块或土堆砌，以利保蓄雨水。将各小台面连起来看，好似鱼鳞状排列。(3)回填表土和有机肥。在筑鱼鳞坑时，要将表土填入定植穴，并施入有机肥料。这样,栽植的果树才能健壮生长。撩壕，是在山坡上，按照等高线挖成的等高沟。把挖出的土在沟的外侧堆成垄，在垄的外坡栽果树，这种方法可以削弱地表径流,使雨水渗入在撩壕内，既保持了水土，又可增加坡的利用面积(图2-3)。(1)确定等高线。其方法与等高梯田相同。(2)挖撩壕。撩壕规格伸缩性较大，一般自壕顶到沟心，宽1～1.5米，沟底距原坡面25～30厘米，壕外坡宽1～1.2米，壕高(自原坡面至壕顶)25～30厘米。撩壕工程较小，简单易行，而且坡面土壤的层次及肥沃性破坏不大，保水性好，还增厚了土层，有利于果树生长，适合于坡度较小的缓坡(5°左右)地建园时采用。但撩壕没有平坦的种植面，不方便施肥管理，尤其在坡度过大(超过10°)时，撩壕堆土困难，壕外土壤流失大。因此，撩壕应用范围小，是水土保持的措施。(3)回填表土。把事先挖出的表土与肥料回填于沟内。回填有两种方式，即将基肥与土拌匀填回沟内和基肥与土分层填入。平地包括旱田、平缓旱地、疏林地及荒地。规模在10公顷以上的果园，可采用重型大马力拖拉机进行深犁(30厘米)，重耙2次后，与坡度垂直方向定线开行和定坑，根据果树树种确定行株距。如坡度在5°～10°可按等高线定行,按同坡向1公顷或2～3公顷为一小区，小区间留1米宽的小道，4个以上的小区间设3米宽的作业道与支道相连。果园内设等高防洪、排水、蓄水沟，防洪沟设于果园上方，宽约100厘米、深约60厘米；排水和蓄水沟深约30厘米、宽约60厘米。规模在10公顷以下的小果园，由于设在平地或平缓地，应精心开垦和进行集约化栽培管理，在有限的土地面积中夺取最高效益。开垦中尽量采用大马力重型拖拉机进行深耕并重耙2次，然后根据地形地势和果树树种按等高或直线确定行株距。地势坡度为5°～10°，可采用水平梯田开垦，根据果树树种确定行株距;地势坡度在5°以下，地形完整的经犁耙可按直线开种植畦，畦中开浅排水沟，沟宽约50厘米、深约20厘米，种植坑直径约1米、深0.8～1米。如在旱田或地下水位高的旱地建园，必须深沟高畦，以利排水和果树根系正常生长。在海拔高度为400米以下、坡度为20°以内的丘陵地建果园较为适宜。(1)兴建10公顷以上的果园。坡度在10°～15°、坡地面积在5公顷以上、海拔在200米以下的丘陵地，可采用45匹马力左右履带式或中型机具挖土和推地于一体的多功能拖拉机，先按行距等高定点线推成2～3米宽水平梯带，而后再按株距定点挖种植坑(1米见方)。海拔在200～400米、坡高度在15°～20°、坡地面积在5公顷以下的丘陵地,先按行距等高定点线推成1～1.5米宽水平梯带，而后按株距定点挖成0.6米×0.6米×0.6米的种植坑。(2)兴建10公顷以下的果园。可根据开垦地海拔高度、坡度，以坡面大小进行等高定行距，先开成水平梯带，然后按株距挖坑；或者根据行距等高线定株距挖坑。种植后力求在2年内，结合扩坑压施绿肥、作物秸秆、有机肥改土时逐次修成水平梯带，方便今后作业、水土保持和抗旱。开垦和挖坑应在回坑、施基肥前2个月完成，使种植坑壁得到较长时间的风化。洼地、水稻田地表土肥沃，但土层薄，能否排水、降低地下水位是种植果树成功的关键。因此,在洼地、水稻田建果园应考虑能排能灌，即雨天能排水、天旱时能灌水，可采用深、浅沟相间形式，即每两畦之间挖1条深沟蓄水、1条浅沟为工作行。洼地、水稻田种果树不能挖坑，应在畦上做土墩，可根据地下水位的高低进行整地，确定土墩的高度，必须保证在最高地下水位时，根系活动土壤层至少保持60～80厘米。在排水难、地下水位高的园地，土墩的高度最少要有50厘米，土墩基部直径120～130厘米，墩面宽80～100厘米，呈馒头形土堆。地下水位较低的园地，土墩可以矮一点，土墩高30～35厘米，墩面直径80～100厘米，畦的四周要开排水沟，保证排水通畅。墩高确定以后，就可依已定的种植方式和株行距标出种植点，然后筑墩。筑墩时应把表土层的土壤集中起来做墩，并在墩内适当施入有机肥。无论高墩式或低墩式，种植后均应逐年修沟培土，有条件的还应不断客土，以增大根系活动的土壤层，可把畦面整成龟背形，以利于排除畦面积水。选择壮苗是柑橘(砂糖橘)早结丰产的基础。壮苗的基本要求:品种纯正，地上部枝条生长健壮、充实，叶片浓绿有光泽。苗高35厘米以上，并有3个分枝。根系发达，主根长15厘米以上，须根多，断根少。无检疫性病虫害和其他病虫害，所栽苗木最好是自己繁育或就近选购的，起苗时尽量少伤根系，起苗后要立即栽植。营养篓假植苗木与大田苗木直接上山定植相比，具有以下优点。(1)成活率高。春季定植，多数为不带土定植。由于取苗伤根，特别是从外地长途调运的苗木,往往是根枯叶落，加上瘦土栽植，成活率低，通常只有70%～80%。而采用营养篓假植苗木移栽，苗木定植后成活率达98%以上。(2)成园快。常规建园栽植，由于缺苗严重，不但补栽困难，而且成活苗木往往根系损伤过重，春梢不能及时抽发，影响正常生长,造成苗木大小不一，需要2～3年才能成园。而营养篓假植苗木，可充分发挥营养篓中营养土和集中培育管理的作用，使伤根及早得到愈合，春季能正常抽发春梢，不但避免了春栽的缓苗期，同时还减少了缺株补苗过程，可使上山定植苗木生长整齐一致，实现一次定植成园。(3)投产早。营养篓假植苗，由于营养土供应养分充足，避免了缓苗期，上山栽植当年就能抽生3～4次梢，抽梢量大，树冠形成快，投产早。(4)集中管理。由于营养篓假植苗木相对集中，可以采用塑料薄膜等保温措施，防止苗木受冻；同时，还可以集中防治病虫害。由于营养篓假植苗定植时不伤根，没有缓苗期，因此可以周年上山定植。合理密植是现代化果园发展的方向，可以充分利用光照和土地，使柑橘(砂糖橘)提早结果，提早收益，提高单位面积产量，提早收回投资。提倡密植，但并不是愈密愈好，栽植过密，树冠容易郁闭，果园管理困难，植株容易衰老，经济寿命缩短。通常在地势平坦、土层较厚、土壤肥力较高、气候温暖、管理条件较好的地区，栽植可适当稀些，株行距可采用2.5米×3米的规格，每667平方米栽植88株左右。在山地和河滩地，以及肥力较差、干旱少雨的地区栽植可适当密些，株行距为2米×3米，每667平方米栽植110株左右。柑橘(砂糖橘)的栽植时期，应根据其生长特点和当地气候条件确定。一般在新梢老熟后至下一次新梢抽发前，均可以栽植。(1)大田繁殖苗木的栽植时期。通常分为春季栽植和秋季栽植。春季栽植，以2月底至3月份进行为宜,此时春梢转绿，气温回升，雨水较多，容易成活，可省去秋植灌水之劳。秋季栽植,通常在9月下旬至10月份秋梢老熟后进行,这时气温尚高，地温适宜，只要土壤水分充足，栽植苗木根系的伤口就愈合得快，而且还能长出一次新根，有利于翌年春梢的正常抽生。秋季栽植常会遇秋旱，需要有灌溉保证，而且还有可能遭受寒冻，因此秋季栽植可用营养篓(袋)假植。秋植比春植效果好，这是因为秋季时间长,可充分安排劳力，而且当年伤口易于愈合，根系容易恢复，所以秋植苗木成活率高，翌年春苗木长势好。栽植最好选在阴天或阴雨天进行，遇毛毛雨天气可以栽植，但大风大雨不宜栽植。(2)营养篓假植苗栽植时期。营养篓假植苗通常不受季节限制，随时可以上山定植，但夏秋干旱季节，降雨少、水源不足栽植会影响成活率。所以，最佳移栽时期是春梢老熟后、5月中下旬至6月上中旬。(1)大田苗木栽植方法。栽植前，解除薄膜，修理根系和枝梢，对受伤的粗根剪口应平滑，并剪去枯枝、病虫枝及生长不充实的秋梢。栽植时，根部应蘸稀薄黄泥浆，泥浆浓度以手沾泥浆不见指纹而见手印为适宜。泥浆中最好加入适量的细碎牛粪，并将1.8%复硝酚钠水剂600倍液+70%甲基硫菌灵可湿性粉剂500倍液混合，加入泥浆中搅拌均匀，然后蘸根，以促进生根。注意泥浆不能太浓，否则会引起烂根；复硝酚钠加入太多会引起死苗。种植时，两人操作，将苗木放在栽植穴内扶正，理顺根，让新根群自然斜向伸展，随即填以碎土，一边埋土，一边均匀踩实，并将树苗微微振动上提，以使根、土密接，然后再加土填平。栽植后在树的周围覆盖细土，土不能埋过嫁接口部位，并要做成树盘。树盘做好后，充分灌水，水渗下后，再于其上覆盖一层松土，以利保湿。栽植过程，要真正做到苗正、根舒、土实和水足，并使根不直接接触肥料，防止肥料发酵而烧根。树盘可用稻草、杂草等覆盖。(2)营养篓苗栽植方法。定植前,先在栽植苗木的位置挖定植穴(穴深与篓等高为宜)，将营养篓苗置于穴中央，去除营养篓塑料袋后，用肥土填于营养篓四周，轻轻踏实，然后培土做成直径1米左右的树盘,浇足定植水，栽植深度以根颈露出地面为宜。树盘做好后覆盖稻草，可保湿、防杂草滋生、保持土壤疏松。柑橘(砂糖橘)苗木定植后如无降水，在定植后的3～4天，每天均要淋水保持土壤湿润。以后视植株缺水情况，每隔2～3天淋水1次，直至成活。栽植后7天，穴土已略下陷可插竹枝支撑固定植株，以防风吹摇动根群，影响成活。若发现卷叶严重，可适当剪去部分枝叶，以提高成活率。一般植后15天左右部分植株开始发根，30天后可施稀薄肥，可用腐熟人粪尿加水5～6倍，或0.5%尿素溶液，或0.3%三元复合肥溶液浇施，每株浇施1～2千克。如果用绿维康液肥100倍液浇施,则效果更好，可促使幼树早发根、多发根。以后每月淋水肥1～2次，注意淋水肥时不要淋在树叶上，施在离树干10～20厘米的树盘上即可。新根未发、叶片未恢复正常生长的植株不宜过早施肥，以免引起肥害，影响成活。