番茄被认为是蔬菜中的一种重要的健康食品。它含有丰富的营养，不仅含有丰富的纤维素，而且不含胆固醇，脂肪的含量也较低。近来培育的鲜食品种之一——樱桃番茄，兼有水果和蔬菜的特点，尤其受到人们的青睐。其风味独特，果汁富含甘汞，对肝病有良好的治疗效果，并有利尿、保肾等功能；果皮茸毛能分泌路丁，可降血压、预防动脉硬化和脑溢血，还有杀菌、美容、解毒等作用。由于自身的生物特性等原因，番茄果实在果实采前，采收期以及在果实采后的贮存和运输过程中容易受到多种病原真菌的侵染，从而导致采后病害的发生。其中灰霉病（Botrytis cinerea）是采后的主要病害，常在贮藏期以及货架期引起果实腐烂，造成较大的经济损失。目前番茄采后病害仍主要采用化学杀菌剂来防治，如使用多菌灵或扑海因浸泡果实，速克灵或农灵利喷洒果实等。化学药剂控制采后病害有良好效果；但是，长期使用化学农药导致病原菌产生抗药性而降低防效；同时，农药在果实上的残留量增加而威胁人类健康，并造成环境污染。生物防治作为一种更加安全有效的防治果实采后病害的新技术已引起人们的广泛关注，并成为研究热点。枯草芽孢杆菌C27（Bacillus subtilis strain C27）是由中国农业大学植物病理学系植物细菌及病害生物防治实验室分离得到的一株生防细菌。前期研究发现，其对番茄苗期和成株期灰霉病有良好的防治效果。本研究探索了C27菌株用于采后番茄果实灰霉病的防治。结果表明，在离体条件下，C27代谢液能明显抑制病原菌Botrytis cinerea的孢子萌发和菌丝生长，在25°C和2°C下对番茄果实灰霉病均有明显的防治效果。与不刺伤和刺伤接种无菌水的对照相比，C27处理在25°C和2°C下均能提高番茄果实内多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）的活性以及增加果实的总酚含量（TPC）。C27菌株对番茄果实灰霉病具有明显的防治效果，其防效在于对病原菌的直接抑制作用以及对果实抗病防御反应的诱导作用。

为了减少化学杀菌剂对环境的污染和在农产品中的残留，对环境友好的生防微生物制剂受到普遍重视。在已经研究的生防菌中，木霉属下的若干种因适应能力强、抗病谱广、拮抗机制多样化而被广泛用于防治植物病害。研究发现木霉对病原菌的作用机制是多种多样的，主要包括抗菌、溶解、竞争、重寄生等，目前还发现木霉制剂除具有直接抑菌功能外，还具有一定的诱导作物产生抗性的作用，这对提高木霉防病的持效性和稳定性具有重要意义。我们从土壤中筛选分离出一株具有很强生长势的木霉，经鉴定为绿色木霉Trichoderma viride，通过体外拮抗试验，证明该菌具有极明显的竞争优势，能快速地占据生长空间、获取营养，对灰葡萄孢霉、立枯丝核菌、瓜果腐霉、茄链格孢等均有强烈的抑制效应，盆栽接种和温室防治试验试验表明对立枯丝核菌所致茄子立枯病和灰葡萄孢霉所致番茄灰霉病均具有明显的防治效果。因此，有可能发展成为一种纯生物的植物病害防治剂。作为一类重要的自然资源，木霉已引起国内外研究者的广泛关注。因此，木霉的培养及发酵条件是工业化大批量生产木霉菌制剂的前提。本文主要对我们筛选出的生防有效菌绿色木霉的放大发酵培养条件进行了研究，其结果对于绿色木霉和多功能生物制剂的工业化生产具有一定的指导意义。绿色木霉Tr9701（Trichoderma viride），由天津植保所病害室筛选、鉴定、保存菌株。1.2.1 不同培养基与绿色木霉生长和孢子形成、萌发的关系 将绿色木霉菌丝块（直径5mm）分别置于MA培养基、小麦粉培养基、豆粉浸出液培养基、PDA培养基、PSA培养基、土壤浸液琼脂培养基、水琼脂培养基、CA培养基等上，在25℃下培养，每处理重复4皿，24h、48h、72h、96h、7天后测量菌落直径，观察菌落生长和孢子着生情况。将木霉菌孢子在1%葡萄糖营养液、1%蔗糖营养液、10%土壤浸出液和蒸馏水中，25℃培养，0h、4h、6h、24h后调查孢子萌发情况。1.2.2 温度与绿色木霉菌丝生长及孢子形成的关系 将菌块移入PSA平板培养基上（定量为12ml），置于10～35℃共6个温度梯度内培养，分别于培养24h、48h、72h、96h、7天后测量菌落直径，比较不同温度下菌丝生长差异，并观察各处理中产孢情况。同时将试管斜面上培养4天的木霉菌分别放入温度为35℃、45℃、55℃、65℃的水浴锅内，每温度放4个试管，分别在5min、10min、15min、20min各取1管，在无菌条件下将菌丝挑入PSA平板上，于25℃温箱内培养，观察木霉菌生长情况，明确持续高温对绿色木霉菌丝伸长、孢子着生的影响。1.2.3 pH值与绿色木霉菌丝生长及孢子形成的关系 将灭菌后的PSA培养基，用HCl和NaOH调节其pH值分别为1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13，在不同pH值培养基上接种菌块，25℃恒温培养，24h、48h、72h、96h、7天后观察pH值对绿色木霉菌丝伸长、孢子着生的影响。1.3.1 固体发酵基质原料的确定及培养基的优化 试验设计的培养基配方由固定成分和附加成分组成，固定成分以小麦全麦为主，附加部分黄豆粉、糖类和酵母浸膏（具体见表7）。利用设计的配方培养绿色木霉（接种浓度5×106个孢子/ml，基质：菌液=10：1），观察不同配方培养下绿色木霉菌丝和产孢量的情况，确定利于绿色木霉培养的固体发酵基质配方。1.3.2 固体发酵基质中含水量的确定 由筛选获得的固体发酵基质配方中，加入不同比例的水分。含水量试验设计为麦粒：水比例1：0.6、1：0.8、1：1、1：1.2、1：1.4，利用设计的不同含水量配方培养绿色木霉（接种浓度5×106个孢子/ml，基质：菌液=10：1），观察不同含水量下培养绿色木霉菌丝和产孢量的情况，确定利于绿色木霉培养的固体基质中含水量。1.3.3 培养时间对绿色木霉产孢的影响 以筛选获得的固体基质配方作为木霉菌发酵基质培养绿色木霉（接种浓度5×106个孢子/ml，基质：菌液=10：1），观察发酵过程中木霉菌在培养基质中的种群密度变化，定时取样，以血球计数板计数培养物中绿色木霉孢子着生量。1.3.4 利用食用菌废料的固体发酵基质原料的确定及添加成分、比例的优化 首先通过可行性试验明确食用菌废料是否能够提供木霉菌繁殖的基本营养。配方筛选试验设计的培养基配方由固定成分和随机成分组成，固定成分以食用菌废弃培养料（自然风干）为主，附加部分麦麸和无机营养元素；随机成分有酱油渣、玉米芯、黄豆渣、锯木屑、稻杆等（自然风干）废弃物。以食用菌废料、麦麸、无机盐为固定成分分别与其他废弃物按照一定的比例称量350g，料：水为1：1，放在广口玻璃瓶中，灭菌后接种木霉孢子悬浮液（接种浓度5×106个孢子/ml，35ml/瓶），设4次重复，25℃恒温培养，6天后调查结果。用不同培养基25℃培养绿色木霉，生长速度测定结果见表1。由结果可知，绿色木霉菌在供试的几种培养基上均能生长。从生长速度上看，以小麦粉和豆粉浸出液培养基上生长速度最快，是其生长的最适培养基，菌丝培养72h即长满全皿，且菌丝浓密；PDA、PSA、CA培养基相对次之，三者之间生长速度无明显差异；绿色木霉在水琼脂培养基上7天可以长满全皿，但菌落极为稀疏；以MA培养基、土壤浸出液培养基上生长速度最慢，25℃培养7天菌落直径分别为26.00mm和26.25mm。培养基菌落直径（mm）24h48h72h96h7天MA培养基5.258.1310.5013.7526.00小麦粉培养基14.2558.50满豆粉浸出液15.2550.50满PDA10.5041.7579.25满PSA11.0037.7568.50满土壤浸出液5.007.3811.3815.5026.25水琼脂5.5022.5040.2557.50满CA培养基13.0041.0068.75满表1 绿色木霉不同营养条件下菌落生长速度用不同培养基培养观察其孢子着生情况（结果见表2）。由结果可知，该菌在几种培养基上均能产生孢子，从孢子形成的速度和数量上看，以小麦粉和PDA培养基孢子生成的速度最快，产生的孢子数量最多；其次是豆粉浸出液、PSA和CA培养基；以MA培养基、土壤浸出液和水琼脂3种培养基上孢子生成速度最慢，产生量最低。培养基孢子分布直径（mm）24h48h72h96h7天附注MA培养基005.885.886.00+小麦粉培养基0034.25满++++豆粉浸出液0022.2561.00满+++PDA014.6330.25满+++PSA07.0023.7565.00满+++土壤浸出液00008.5+水琼脂0000满+CA培养基07.2519.0061.00满++表2 绿色木霉不同营养条件下培养孢子着生情况由绿色木霉分生孢子在不同营养液中萌发试验可知（结果见表3），其分生孢子在几种营养液中均可萌发，但以1%葡萄糖溶液中萌发效果最好，24h萌发率为30%，48h萌发率为95.5%；10%土壤浸出液中萌发效果最差，24h萌发率为1.5%，48h萌发率为45%；其他几种液体中孢子萌发率24h为4.00%～5.67%之间，48h为76.0%～78.2%。营养液孢子萌发率（%）0h4h6h24h48h1%葡萄糖00030.0095.51%蔗糖0004.0076.010%土壤浸出液0001.5045.0蒸馏水0005.6778.2表3 绿色木霉不同营养液中孢子萌发情况绿色木霉于不同温度下培养，测量其生长速度结果见表4。由结果可知，绿色木霉在10～35℃均能生长，25℃时72h内就能长满培养皿，20℃、30℃时需要96h，15℃时则需要7天，10℃、35℃时第7天仍未长满全皿。20～30℃为绿色木霉的生长适温，25℃为生长最适温度。培养温度（℃）菌落直径（mm）24h48h72h96h7天106.256.317.759.6338.35158.7510.0627.1344.50满2013.5045.3879.83满2519.6358.50满3018.8855.1377.67满3511.3112.2512.5013.7516.5表4 绿色木霉不同温度下菌落生长速度将绿色木霉于不同温度下培养，观察其孢子着生情况、测量其孢子蔓延速度，结果见表5。从结果显示，绿色木霉在15～30℃均能形成分生孢子，其中适宜适温为20～30℃，温度在20℃以下和30℃以上能产生分生孢子但速度减慢，如25℃时96h内产生的分生孢子就能布满培养皿，20℃、30℃时需要7天，15℃时第7天分生孢子仍未布满全皿。因此，25℃为绿色木霉的分生孢子形成的最适温度。培养温度（℃）孢子分布直径（mm）24h48h72h96h7天100000015000066.50200017.7576.5满2506.543.00满300047.2584.5满3500000表5 绿色木霉不同温度下孢子着生情况绿色木霉在不同pH条件下培养，结果见表6。由结果可明显看出，pH值在5～9环境下培养，绿色木霉可以生长，其中pH在5.5～6间生长最适，pH值在8以上生长较为缓慢，由此可见绿色木霉喜好在中等偏酸性条件下生长。绿色木霉孢子着生也表现相似规律，pH值在5～8环境下孢子均可着生，以pH在5.5～6间最适。pH菌落直径（mm）孢子分布直径（mm）24h48h72h7天24h48h72h7天100000000200000000300000000400000000512.0036.0063.38满0015.560.05.52163.38满0033.5满621.6366.38满06.242.0满79.5030.5054.00满0028.2满807.7515.5045.75005.549.25907.008.0022.0000001000000000110000000012000000001300000000表6 pH值对生防木霉菌菌丝伸长、孢子着生的影响不同固体发酵基质原料培养绿色木霉效果见表7。由结果可以看出，在以小麦粒为主的固定成分中加入糖类和酵母浸膏，菌丝量和产孢量最高，如果在发酵过程多次搅拌，可保证整个基质内、外表充满黄绿色孢子。在加入其他成分的配方中菌丝、产孢量均不及前者多，因此通过试验获得的绿色木霉固体发酵基质原料配方为：小麦粒+葡萄糖+酵母浸膏。配方菌丝生长量孢子产生量说明全麦粉+黄豆粉+葡萄糖+酵母浸膏++仅表面分布黄绿色孢子通气性较差全麦粉+葡萄糖+酵母浸膏+仅表面分布黄绿色孢子通气性较差全麦粉+黄豆粉++仅表面分布黄绿色孢子通气性较差小麦粒+黄豆粉+葡萄糖+酵母浸膏++麦粒表面密生黄绿孢子麦粒和豆粉附着性稍差小麦粒+葡萄糖+酵母浸膏+++麦粒表面密生黄绿孢子适宜木霉菌生长小麦粒+黄豆粉++麦粒表面密生黄绿孢子麦粒、豆粉附着性稍差表7 绿色木霉孢子发酵配方筛选试验将固体发酵基质中加入不同比例水培养绿色木霉效果见表8。由结果可以看出，在以小麦粒为主的固定成分中加入不同水量，其对绿色木霉的菌丝量和产孢量影响较大，以固麦粒和水比例为1：0.8～1：1.0的菌丝、产孢量最多，如果在发酵过程多次搅拌，可保证整个基质内、外表充满黄绿色孢子。处理含水比例菌丝生长量孢子产生量说明麦粒：水1∶0.6++菌丝着生处生长黄绿色孢子含水量过低菌丝少麦粒：水1∶0.8+++整个料体着生黄绿色孢子适宜木霉菌生长麦粒：水1∶1+++整个料体着生黄绿色孢子适宜木霉菌生长麦粒：水1∶1.2++孢子主要在上半层分布基料下层含水量较高麦粒：水1∶1.4+孢子着生较少含水量过高表8 绿色木霉固体发酵基质中含水量试验以筛选获得的固体发酵基质配方作为木霉菌发酵基质培养绿色木霉，发酵过程中木霉菌在培养基质中的种群密度变化结果见表9，接种48h后，内部有菌落产生，第3～4天，整个基质全部被白色菌丝覆盖，随后，料体表面有黄绿色孢子大量产生，随着时间的推移，绿色木霉的孢子量增长迅速，到第6天培养料中孢子量达332.4×106个/g，以后孢子量增长缓慢。因此为了缩短发酵时间，降低发酵成本，发酵6天就能达到预期的要求。重复孢子密度计数（×106个孢子/g）2天3天4天6天8天平均8.3351.798.9332.4357.4表9 不同时期绿色木霉孢子种群密度变化为进一步降低生产成本，本试验设计以食用菌废弃培养料为主，附加部分麦麸和无机营养元素；随机成分有5种废弃物。配方设计及其培养木霉孢子效果见表10。由结果可以看出，在以食用菌废料为主的固定成分中加入黄豆渣，菌丝量和产孢量最高，整个基质外表充满黄绿色孢子，内部由于光照不充足产孢量较少，如果在发酵过程搅拌1～2次，可以促进产孢。在加入其他成分的配方中菌丝、产孢量均不及前者多，因此通过试验获得的最佳配方为：食用菌废料+麦麸+黄豆渣+无机营养元素。配方菌丝生长量孢子产生量食用菌废料+麦麸+无机营养元素+酱油渣++上表面零星分布黄绿色孢子食用菌废料+麦麸+无机营养元素+玉米芯++上表面零星分布黄绿色孢子食用菌废料+麦麸+无机营养元素+黄豆渣+++料体整个表面有黄绿色孢子食用菌废料+麦麸+无机营养元素+锯木屑+几乎没有黄绿色孢子产生食用菌废料+麦麸+无机营养元素+稻杆++上表面零星分布黄绿色孢子表10 木霉菌利用食用菌废料等的发酵配方筛选以筛选获得的食用菌废料培养基作为木霉菌发酵基质培养木霉菌，发酵过程中木霉菌在培养基质中的种群密度变化结果见表11，接种48h后，内部有菌落产生，第3～4天，整个基质全部被白色菌丝覆盖，随后，料体表面有黄绿色孢子大量产生，随着时间的推移，绿色木霉的孢子量增长迅速，到第6天培养料中孢子量达248×106个孢子/g，以后孢子量增长缓慢。因此为了缩短发酵时间，降低发酵成本，发酵6天就能达到预期的要求。重复孢子密度计数（×106个孢子/g）2天3天4天6天8天平均7.153.899.8248.7259.3表11 不同时期绿色木霉孢子种群密度变化迄今为止，利用木霉菌防治植物病害的研究已有近60年的历史，并且研究工作大多集中于木霉菌资源的筛选和作用机理方面，在木霉菌人工发酵方面的报道较少。我们通过对生防木霉菌培养条件的研究，进一步获得了其以麦粒为主及食用菌废料为主的固体发酵技术，可以用于绿色木霉的人工发酵，这将为绿色木霉菌产品的制剂化的生产提供技术支持。

哈密瓜细菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch，BFB）是由Acidovorax avenae subsp.citrullii，（Aac）引起的一种毁灭性的瓜类病害，该病菌已经成为了全球瓜类生产中巨大的威胁。中国至今已有12个省相继有该病的报道。目前，该病因其无免疫品种和特效的化学农药，轮作倒茬存在局限性等原因，有效防治该病仍然是一个难题。近几年已有人报道利用生物防治BFB来改变目前防治现状，但多以生防细菌为主（卢云等，2007；Fessehaie和 Walcott，2004），利用拮抗酵母防治瓜类细菌性果斑病国内外未见有报道。2006～2007年，本实验组从湖北武汉、新疆石河子、河南信阳等地采集不同植物叶片、土壤样品进行了酵母菌的分离，获得了463菌株。通过含菌平板测定拮抗性，表明有29个酵母菌菌株对Aac有拮抗作用，占总分离酵母菌株的6.3%，抑菌圈半径大于5mm的有13个。在温室盆栽试验中，将其中的13个酵母菌菌株的菌体悬浮液（1.2×108菌体/ml）分别喷雾接种于哈密瓜苗四叶期的植株上，24h后接种Aac菌体悬浮液（1.0×108cfu/ml），处理后的瓜苗放入温棚内，棚内温度为（32±2）℃，相对湿度大于90%。接种5天后调查各处理哈密瓜苗的发病情况。试验结果表明：菌株Y06109、Y07039和Y0709在哈密瓜子叶或第一片真叶上对BFB具有显著的防治效果。3株酵母菌处理的哈密瓜子叶发病率分别为33%、33%和76%，对照为96%，防效分别为65%、65%和21%。第一真叶发病率分别为14%、17%和10%，对照为96%，防效分别为80%、84%和90%。这些研究结果表明，拮抗酵母的一些种类或菌株对BFB具有一定的生防潜力。对于筛选出的具有抑菌作用的酵母菌株，将进一步测定其田间防病效果，并对其显著防效的拮抗酵母进行种类鉴定。

重寄生菌盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的一种重要生防菌。这种生防菌在其自然生境—土壤中寄生致腐核盘菌菌核，从而达到阻断核盘菌侵染循环及防治核盘菌的目的。为了充分挖掘盾壳霉的防病潜力，必须了解盾壳霉在土壤中的扩散规律。在以前的研究中，获得了一株对杀菌剂农利灵表现高度抗性的突变菌株SV-5-2，以之为基础，建立了一种选择性分离盾壳霉的方法（Yang等，2007）。本研究采用选择性分离的方法探讨了盾壳霉在5种不同土壤（黄棕壤、红壤、潮土、黑土、沙子）中的垂直扩散和水平扩散的动态规律。垂直扩散的研究结果表明：盾壳霉的分生孢子可以随水分在5种不同土壤中垂直扩散到20cm深处。盾壳霉的种群数量随深度的增加而呈数量级减少。例如，在40%含水量黄棕壤中扩散24h后，土壤表层（0～2cm）盾壳霉的数量为4.0×107cfu/g干土，而底层盾壳霉的数量为（16～20cm）则为0.6×103cfu/g干土。研究还发现：盾壳霉在沙子中的垂直扩散效果最好。这可能与土壤中的含沙量、黏性和吸附性有关。同时盾壳霉在40%和60%含水量（绝对含水量）的土壤中的垂直扩散没有显著差异（P>0.05）。水平扩散的研究结果也表明：盾壳霉的分生孢子可以随水分在4种不同的土壤（黄棕壤、红壤、潮土、黑土）中水平扩散距离为10cm，在沙子中水平扩散距离为20cm。盾壳霉的种群数量随距离的增加而呈数量级减少。例如，在黄棕壤中，距离接种点0～5cm处盾壳霉的数量为为4.4×106cfu/g干土，在5～10cm距离中下降到1.3×104cfu/g干土，超过10cm距离的土壤中检测不到盾壳霉。盾壳霉在沙子中的水平扩散效果明显好于其他4种土壤（黄棕壤、红壤、潮土、黑土），这可能与土壤中的含沙量、黏性和吸附性有关。盾壳霉能随水分垂直扩散20cm深，水平扩散10cm远，基本覆盖了土壤的耕作层和油菜种植的行间距。这为田间通过浇水使用盾壳霉孢子进行土壤处理来寄生核盘菌菌核，从而防治菌核病提供了理论依据。

由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的棉花黄萎病是棉花的主要病害。该病于1914年在美国弗吉尼亚州首次发现，以后随着棉种的调运传播到世界各个棉花主产国[1，2]。我国每年棉花黄萎病发病面积达2×106hm2，重病田病株率高达95%以上，造成极大的经济损失。棉花黄萎病的防治已成为世界棉花生产中的难题。国内外在抗病育种、农业措施和化学防治等方面做了大量工作，对控制此病的危害起到重要作用[3，4]。但目前生产上高抗丰产品种少、有效化学药剂匮缺、农药残留和抗药性问题突出。由于生物防治能克服上述弊病，被认为是一种有效且具有发展潜力的重要防治方法，而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。关于棉花黄萎病拮抗菌的筛选，国内外已做了不少研究工作。有报道指出，芽孢菌、荧光假单孢菌、葡柄霉、链霉菌、黄色蠕形菌对大丽轮枝菌都有拮抗作用；Bacillus和Pseudomonas属的某些细菌能有效抑制大丽轮枝菌的生长和使部分分生孢子死亡；木素木霉（Trichoderma ligmerum）的某些菌系有明显的防病增产作用；植物内生菌及根际土壤细菌诱导棉花对大丽轮枝菌抗性[5～9]。由于棉花黄萎病菌存在生理分化现象，不同地区的温度、湿度、光照、植被等生态条件有异，因而不同地区筛选出的棉花黄萎病拮抗菌菌种的适应性和对棉花黄萎病菌的拮抗作用存在显著差异[10]。安徽目前尚未见关于棉花黄萎病拮抗菌筛选鉴定的研究鲜有报道[11，12]。因此，有必要在安徽地区开展对棉花黄萎病的生防研究。作者从安徽主要棉区广泛采集棉花根围土样，经室内分离获得细菌菌株120株，真菌菌株97株，经拮抗活性筛选，发现ZXC-9等7个菌株对棉花黄萎病菌具有较好的拮抗作用，可望应用于棉花黄萎病的生防。现将研究结果报道如下。供试病原菌棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb） 菌株HF和WW3，供试生防菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株BS，均由安徽农业大学植物病原真菌研究室提供。真菌分离采用查氏酵母浸膏培养基和PDA培养基，细菌分离采用营养琼脂培养基（NA）和NB培养液，配制方法均参照文献[13]。1.3.1 土样的采集 在棉花黄萎病害发病田块采样，采用五点取样方法。取健康的棉花植株根土，取样时拨开土表（约5cm深），每样取50g（同地区取样至少相距100m以上），晾干后4℃保存待用。1.3.2 微生物的分离 取10g的土样放在量筒中，加入内装100ml无菌水的三角瓶中，于摇床上振荡2h。取1ml的悬浮液，加入9ml的灭菌水中，依次稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，各浓度取上悬浊液0.1ml涂于选择性培养基平板上，每浓度设3个重复。置于28℃±1℃恒温箱中培养24h后进行细菌检查，真菌和放线菌培养72h后调查，分别记录其菌落数。1.4.1 真菌对棉花黄萎病菌的拮抗作用测定 将分离菌与棉花黄萎病菌HF菌株对峙接种于PDA平板上（φ=9cm），菌丝块直径0.7cm，两菌块接种点相距4cm，并以单独接种棉花黄萎病菌的处理为CK，每处理重复3次，25℃恒温培养，连续7天观察菌落的相互影响，并在两菌株接种点连线上测定接种点到菌落前缘的距离，按下式计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×1001.4.2 棉花黄萎病菌拮抗真菌的鉴定 在PDA平板上对拮抗真菌菌株进行培养，观察、记载菌落、菌丝、产孢结构和孢子形态特征，参照真菌字典[14]，对菌株种类做出鉴定。1.5.1 棉花黄萎病菌拮抗细菌的初步筛选 先将培养48h的病原菌（HF菌株）打成直径0.7cm的菌碟，移植在平板中央，同时将分离到的细菌培养24h后，接种在平板周围，每皿6点，待测菌与病原菌距离为3.5cm，置于28℃培养48h后，检查抑菌圈有无并测量其大小。抑菌带（D-D0）=细菌抑菌圈直径-细菌菌落直径拮抗细菌的分级[15]：0级（-）：D-D0=0（无透明带产生），无拮抗性；1级（+）：0mm＜D-D0＜3.9mm，弱拮抗性；2级（++）：4mm＜D-D0＜7.9mm，中等拮抗性；3 级（+++）：D-D0＞8.0mm，强拮抗性。1.5.2 拮抗细菌对棉花黄萎病菌的拮抗作用测定1.5.2.1 划线法测定结果 初步筛选出的4种细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4和XGC2-9也通过连续10代转移培养，再进行复筛试验。复筛试验并以生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株作为防效对照。具体操作方法如下：用接种环取1环分离出的细菌在含有PDA培养基的培养皿中间划一直线，在距直线两侧2cm处分别接种直径为0.7cm的病原菌菌碟，并以单独接种棉花黄萎病病原菌的处理为对照1（CK1），以接种枯草芽孢杆菌BS菌株的处理为对照2（CK2）。每处理重复3次，在25℃下恒温培养，测定其抑菌效果。测量病原菌向拮抗菌方向生长的长度和对照中病原菌菌落的半径（cm），以R值表示拮抗作用的大小[16，17]。1.5.2.2 杯碟法测定结果 在划线法后选取4种细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4和XGC2-9中抑制效果最为明显的XSZ-5菌株进行杯碟法实验。将活化好的XSZ-5菌株用3ml无菌水洗下，接入100ml的NB培养液中，并置于28℃，转速为100r/min的恒温摇床振荡培养。48h后得到菌量为1010～ 1011cfu/ml的活菌液。然后分别向18ml的PDA培养基中加入2000μl、500μl、100μl和10μl的BS活菌液，混合均匀后倒平板，并在平板上接种直径为0.7cm的病原菌菌碟，同时设置对照（即不加入XSZ-5菌的活菌液），各处理重复3次，25℃下恒温培养7天后测量菌落直径，计算抑菌率[16，17]。对自安徽各主要棉区采集土样进行室内分离，共获得真菌菌株97株。以棉花黄萎病菌HF、WW3为目标菌株，采用平皿对峙试验测定各真菌菌株对棉花黄萎病菌的拮抗作用，结果见表1。从表1可见，通过连续7天的测量观察，发现其中有3种菌株ZXC-9、ZZY-3和ZGC1-1对棉花黄萎病菌具有很明显的抑制效果，7天后抑制率分别达到了69.39%、67.52%和74.30%。拮抗真菌菌株Isolatesofantagonisticfungi项目Item不同处理时间的测定结果Testresultsatdifferenttimeaftertreatment3天4天5天6天7天ZXC-12-1菌落直径（cm）2.012.462.632.853.01抑制率（%）—6.8119.5322.6629.59ZXC-9菌落直径（cm）0.971.131.231.311.31抑制率（%）46.9957.1962.3964.4969.39ZGC1-1菌落直径（cm）0.820.951.001.031.10抑制率（%）55.1964.0269.4272.0974.30ZXC-12-2菌落直径（cm）1.721.932.022.092.18抑制率（%）6.0126.5237.9543.2848.99ZXC-2菌落直径（cm）1.311.721.922.002.12抑制率（%）28.4934.8741.2445.7950.28ZXC-15菌落直径（cm）2.332.672.863.073.08抑制率（%）——12.4716.5528.01ZHS-1菌落直径（cm）2.242.382.762.802.89抑制率（%）—9.8115.6124.0932.54ZXC-14菌落直径（cm）1.321.781.982.072.19抑制率（%）27.6632.5239.5443.7848.89ZZY-3菌落直径（cm）0.961.211.351.361.39抑制率（%）47.5454.1758.7263.1467.52CK菌落直径（cm）1.832.643.273.694.28表1 拮抗真菌菌株对棉花黄萎病菌的抑制作用测定Table 1 Inhibition of isolates of antagonistic fungi against V. dahliae2.2.1 棉花黄萎病菌拮抗细菌初筛结果 经过营养琼脂培养基（NA）分离，筛选得到12株拮抗细菌菌株。抑菌圈试验结果（表2）表明，这12株拮抗细菌菌株对棉花黄萎病菌HF菌株和WW3菌株都有一定的拮抗性，其中XZY-6、XSZ-5、XXX-4和XGC2-9这4个菌株对棉花黄萎病菌的拮抗作用较强，对两种目标菌株的作用效果相似，无明显差异。拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria棉花黄萎病菌菌株IsolatesofV.dahliaeHFWW3拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria棉花黄萎病菌菌株IsolatesofV.dahliaeHFWW3XZY-1--XXX-9++++XZY-6+++++XXX-17+++XSZ-5+++++XZY-5++++XSZ-2+++XXC-3-+表2 12个细菌菌株对棉花黄萎病菌的抑菌试验结果Table 2 Inhibitory tests of 12 strains of bacteria against V. dahliae拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria棉花黄萎病菌菌株IsolatesofV.dahliaeHFWW3拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria棉花黄萎病菌菌株IsolatesofV.dahliaeHFWW3XXX-1+++XXC-5--XZY-8++++XXC-9++XZY-13++XXX-4++++++XGC2-9++++++续表22.2.2 拮抗细菌对棉花黄萎病菌的拮抗作用2.2.2.1 划线法测定结果 测定结果（表3）表明，处理5天后，病原菌菌株向各拮抗细菌方向生长缓慢，各菌株均有明显的抑菌带出现。6天后，各拮抗菌对病原菌菌株的抑制作用R值分别为0.571、0.571、0.563、0.571，均表现出较好的抑制效果，而对照生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株R值则为0.579。各拮抗菌对病原菌菌株的抑制效果与生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株的防治效果相比无显著差异。拮抗细菌菌株Strainsofantagonisticbacteria项目Item不同处理时间的测定结果Testresultsatdifferenttimeaftertreatment2天3天4天5天6天XZY-6处理0.650.680.720.750.75R值0.7360.7010.6610.6360.595XSZ-5处理0.640.670.700.740.74R值0.7270.6910.6420.6270.587XXX-4处理0.660.710.740.750.76R值0.7500.7320.6790.6360.603XGC2-9处理0.650.690.710.740.75R值0.7390.7110.6510.6270.595CK2处理0.630.670.710.720.73R值0.7160.6910.6510.6100.579CKI对照0.880.971.091.181.26表3 拮抗细菌对棉花黄萎病的抑制作用（划线法）Table 3 Inhibition of 4 strains of antagonistic bacteria against V. dahliae by drawing-line method2.2.2.2 杯碟法测定结果 测定结果（表4）表明，XSZ-5菌株培养液对各菌株均有较好的抑制效果，抑制率均在70%左右。各供试菌株在含有XSZ-5活菌液的PDA培养基上均生长极为缓慢，表现出明显的拮抗作用。根据统计软件进行方差分析及差异显著性比较，XSZ-5菌株在不同菌量处理间菌丝生长差异显著，抑制率随菌量的增加而提高。WW3菌株在含有2000μl和10μl的XSZ-5活菌液的处理对菌丝生长的抑制率分别为78.33%和68.44%，且差异不显著。XSZ-5菌株对HF菌株的抑制率高于对WW3的抑制率，但各浓度间差异不显著。处理TreatmentsWW3HF菌落直径Diameter（cm）抑制率Inhibitionrate（%）菌落直径Diameter（cm）抑制率Inhibitionrate（%）CK3.33Aa—3.83Aa—2000μl1.27Bb78.331.17Cc84.98500μl1.30Bb77.191.23BCc83.07100μl1.37Bb74.521.47BCb75.4010μl1.53Bb68.441.67Bb69.01表4 不同浓度XSZ-5培养液对黄萎病菌生长的影响Table 4 Inhibitory effects of different concentration of XSZ-5 strain cultural liquid against V. dahliae对以上3种拮抗真菌菌株进行了培养观察。在PDA平板上，ZGC1-1菌落生长呈放射状，浅褐色，孢子生长迅速，覆盖整个平板底部；显微镜下观察发现，菌丝有隔膜，分生孢子梗顶部膨大形成顶囊，顶囊表面生出小梗，自小梗顶端形成具有串珠状的分生孢子（图1）；ZZY-3菌落质地为气生菌丝发达，菌丝致密菌落底部有辐射状皱褶条纹，孢子产生多，菌落颜色为黄色，分生孢子梗顶部膨大形成顶囊，顶囊表面生出小梗，自小梗顶端形成串珠状的分生孢子，分生孢子串生；ZXC-9菌落气生菌丝发达，菌丝亦生长致密，产孢多，底部有辐射状皱褶条纹，菌落颜色为深绿色。分生孢子梗顶端不膨大，经多次分枝，产生几轮对称或不对称小梗，小梗顶端产生成串的青色分生孢子，有些孢子梗形如扫帚（图2）。根据以上特征，参照真菌分类手册，将菌株ZGC1-1和ZZY-3初步鉴定为曲霉属真菌（Aspergillus sp.）；菌株ZXC-9初步鉴定为青霉属（Penicillium sp.）。图1 两种棉花黄萎病菌拮抗真菌的形态特征Figure 1 Morphology of two species of antagonistic fungi against V. dahliae通过室内平板对峙复筛试验表明，3株真菌菌株ZXC-9、ZZY-3、ZGC1-1和4株细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4、XGC2-9对于棉花黄萎病菌均具有很强的抑制作用。经连续10代的转移培养，3种拮抗真菌菌株对棉花黄萎病菌的抑制效果仍保持稳定，其中以第7天的抑制作用最为明显，抑制率分别为66.58%、68.30%和76.90%。而4种拮抗细菌菌株XZY-6、XSZ-5、XXX-4和XGC2-9，与生防菌枯草芽孢杆菌BS菌株的防治效果相比也无显著差异。处理5天后，病原菌菌株向各拮抗细菌方向生长缓慢，各菌株均有明显的抑菌带出现。杯碟法测定结果表明，其中的XSZ-5菌株培养液对两种病原菌菌株均有较好的抑制效果，抑制率均在70%左右，是筛选出的各拮抗细菌中效果最好的一种。目前生产上对于棉花黄萎病的防治，由于缺乏高抗丰产品种和有效化学药剂，生物防治被认为是一种具有发展潜力的重要防治途径[18]。本研究从安徽主要棉区棉花根围土样中筛选出了对棉花黄萎病菌具有较好拮抗效果拮抗微生物，为研制开发防治棉花黄萎病的新型生防制剂提供了基础和试验依据，对于棉花黄萎病的综合防治以及减少环境污染，减轻棉花黄萎菌的抗药性，促进可持续治理都具有重要意义。关于这些生防菌的鉴定、抗菌活性成分测定、盆钵试验、根际定殖力以及田间试验还需要进一步的试验研究。

虽然应用化学杀菌剂在一定程度上可控制病害的发生，但目前已有越来越多的化学杀菌剂因“3R”现象（Resistance、Resurgence、Residue）而被禁止用于果蔬采后处理。因此，迫切需要寻求新的安全高效的防腐技术以逐步取代化学杀菌剂在果蔬防腐上的使用[1]，因而研究无公害采后病害防治措施势在必行。大量研究表明，植物内生菌除可以给植物提供所需要的营养物质及一些激素外，还参与植物的防卫功能，增强植物抗逆境、抗病害、抗动物危害的能力[2～4]。利用内生菌防治植物病害是个尚待开发的微生物新资源，植物学家、植物病理学家、微生物学家、生态学家及药物学家对此广泛关注和重视。黄皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels]属芸香科（Rutaceae）亚热带常绿果树。原产华南，有1500多年栽培史。果实酸甜可口，风味独特，营养价值高且具有保健及药用价值，是深受人们喜爱的特产果品[5]。近年来，我国黄皮栽培面积不断扩大，产量逐年提高。但黄皮果实采后极不耐贮藏，在自然条件下极易变软腐烂，其中炭疽病是造成采后腐烂的重要原因之一，而极大地制约了黄皮果实的销售[6～8]。本研究拟对黄皮果实炭疽病病原菌的鉴定，并对无病果实果皮中存在的拮抗内生菌进行分离筛选，为黄皮果实炭疽病的生物防治打下基础。黄皮果实：黄皮病果来自院校市场，无病果实采自中国热带农业科学院试验场五队。1.2.1 黄皮果实炭疽病病原菌分离鉴定1.2.1.1 黄皮果实炭疽病病原分离、纯化与形态学观察 采用组织分离法对典型黄皮果实炭疽病病果进行病原菌分离、纯化，获得菌种，并进行单胞分离、纯化、保存备用。将纯化的菌种移至PDA平板上28℃恒温培养，记录病原菌的培养性状，显微观察菌丝体形态、孢子形态大小等。1.2.1.2 黄皮果实炭疽病病原致病性测定 将上述纯化的病原菌随机选取10个菌株在PDA培养基上培养7天后，采用刺伤和无伤两种方式进行致病性测定。每菌株刺伤和无伤接种时均接种5个果实，以无菌PDA培养基块接种为对照，重复3次，接种点用湿脱脂棉保湿24h后，将接种的病原菌和培养基清除，逐日观察发病情况。1.2.1.3 黄皮果实炭疽病病原菌鉴定 经分离纯化后获得的病原菌进行显微观察和采用病组织切片直接显微观察病原菌的形态特征，根据形态学鉴定其种类[6]。1.2.2 黄皮果实炭疽病拮抗内生菌筛选1.2.2.1 黄皮果实内生菌的分离纯化 将无病黄皮果实果皮剪成若干小块，经表面消毒与无菌水漂洗后，一部分组织块直接接种于PDA、NA和GSA培养基上，取剩余的材料1g加入10ml灭菌水研碎混匀，用50μl分别涂布于NA和GSA培养基上，28℃下恒温培养，逐日观察内生菌的生长情况，将不同形态的菌落及时转接到相应的斜面培养基上，并统一编号后于4℃保存备用。1.2.2.2 拮抗菌筛选 采用平板对峙法[9]进行对黄皮果实炭疽病病原菌具有拮抗活性的内生菌筛选。将培养7天的病原菌菌丝块（Φ=5mm）接种于PDA平板中央，采用十字交叉法在离菌块中心40mm处接种分离获得的内生菌，每菌株接种4点，以接种纯PDA培养基或NA培养基为对照，28℃下恒温培养3天后，分别测量对照及接种内生菌后的病原菌菌落直径、接种内生菌后的抑菌带宽度、显微观察接种内生菌后的病原菌边缘菌丝体及孢子的变化，计算平均抑菌率及平均抑菌带宽度、显微观察病原菌有无变化。1.2.3 拮抗菌鉴定 对5株具有强拮抗活性的内生菌进行鉴定。内生菌的培养特征、形态特征及生理生化特性测定采用东秀珠[10]的方法进行测定，试验结果参考《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）[11]及《常见细菌系统鉴定手册》[10]鉴定其种类。2.1.1 黄皮果实炭疽病症状 黄皮果实感病初期，果皮出现水渍状褐色小点，后扩展为圆形、稍凹陷的褐腐状病斑，湿度大时病部表面产生橘红色孢子堆，果汁从病部裂口处溢出。2.1.2 病原菌培养特征及形态特征 经分离纯化，从病健交界处分离获得的病原菌基本表现一致的培养特征，在PDA平板培养基上，菌落初为白色，后变为灰白色，气生菌丝绒毛状，后期产生橘红色黏孢团。直接从黄皮果实病部的橘红色孢子堆镜检观察，分生孢子盘内产生大量褐色有隔刚毛，产孢细胞圆筒形，无色，分生孢子无色单胞，圆筒形，两端钝圆，内含物颗粒状，对分离纯化培养的病原菌进行镜检，菌丝无色，有隔，分生孢子无色，单胞，圆筒形，两端钝圆，大小9.5～16.7（13.6）μm×3.2～5.5（4.2）μm，具1～2个油球。分生孢子萌发后遇硬物则在芽管端部产生一褐色、近圆形或不规则形附着胞。2.1.3 病原菌鉴定 根据病原菌的形态特征、培养特性和致病性测定结果，参考有关文献[8，12～13]，将引起黄皮果实炭疽病的病原菌鉴定为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）。先后12批次从健康黄皮果皮组织上分离获得内生菌532株，其中真菌169株，占总分离物的31.77%；细菌363株，占总分离物的68.23%；但在整个试验中，未分离获得放线菌（见表1）。123456789101112合计百分比（%）内生真菌1212139181814171713101616931.77内生细菌35295616212828314323223136368.23内生放线菌00000000000000合计474169253946424860363247532表1 不同批次分离的内生菌数量2.2.1 拮抗内生菌的筛选 根据平均抑菌率及平均抑菌带宽度、显微观察病原菌菌丝体及孢子有无变化的测定结果看，分离获得的169株内生真菌对黄皮炭疽病病原菌均无拮抗作用，对内生真菌与病原菌交界处的病原菌进行观察，未发现病原菌菌丝体或分生孢子有异常变化。而在分离获得的363株内生细菌中，105株对黄皮炭疽病病原菌有不同程度的拮抗作用，占内生细菌的28.93%（见表2）。对峙培养3天后，5株内生细菌的平均抑菌率大于80%或抑菌带宽度大于10mm，分别为B98、B131、B232、B247和B294。拮抗活性无拮抗活性弱拮抗活性中度拮抗活性强拮抗活性菌株数25852485比例（%）71.0714.3313.221.38表2 内生细菌对黄皮炭疽病菌的拮抗活性5株内生细菌的菌落形态及经染色后观察的菌体形态见表3，生理生化特征见表4。依据参考文献《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）[11]和《常见细菌系统鉴定手册》[1]，5菌株初步鉴定为：B98为荧光假单胞杆菌Pseudomonas fluorescens Migula，B131、B232、B247和B294均为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn。菌株菌落特征形状颜色边缘表面透明度可溶性色素革兰氏染色形态鞭毛染色芽孢运动性B98圆形淡黄色整齐光滑不透明黄绿荧光色素-杆状单根极生-+B131圆形白色不整齐粗糙不透明-+杆状多根周生++B232圆形白色不整齐粗糙不透明-+杆状多根周生++B247圆形白色不整齐粗糙不透明-+杆状多根周生++B294圆形白色不整齐粗糙不透明-+杆状多根周生++表3 黄皮拮抗内生菌的培养特性及形态学菌株厌氧生长氧化酶接触酶明胶液化淀粉水解碳源利用D-葡萄糖L-阿拉伯糖D-木糖D-甘露糖柠檬酸盐葡萄糖产酸B98-+++-+++-++B131--+++++++++B232--+++++++++B247--+++++++++B294--+++++++++石蕊牛奶丙酸盐硝酸盐甲基红V-P反应pH值5.745℃生长吲哚产生H2S产生7%NaClB98还原、胨化++--+--++B131还原、胨化-+-+++--+B232还原、胨化-+-+++--+B247还原、胨化-+-+++--+B294还原、胨化-+-+++--+表4 黄皮拮抗内生菌的生理生化特征通过对病害症状的观察、病原菌的分离纯化、形态学鉴定及致病性进行测定，确定引起黄皮果实炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.），该病原菌是造成黄皮果实腐烂的主要原因之一。通过对无病黄皮果实果皮组织中的内生菌研究表明，果皮中存在丰富的内生菌资源。大量的内生菌与黄皮的生长发育、抗病性等之间的关系有待进一步研究。通过对分离获得的内生菌与黄皮果实炭疽病病原菌（C.gloeosporioides）进行对峙培养，28.93%的内生细菌具有拮抗作用，可见在黄皮果实组织中存在对该病原菌有抑制作用的拮抗菌具有多样性，这可能是黄皮果实抗病力较强的重要原因之一，为开辟黄皮炭疽病的生物防治提供了重要的原材料，为黄皮的无公害生产打下了基础。

杨树水泡溃疡病（Botryosphaeria dothidea）是为害杨树的重要病害，影响植株生长甚至导致死亡，近年来随着杨树栽植面积的快速增大，杨树水泡溃疡病发病益显严重。目前对该病的防治对策以壮树防病结合化学药剂防治为主，鉴于人类对环境质量要求的提高，生物防治日益受到人们关注。植物内生细菌是一种重要的生物农药来源，其不仅可以抑制病原微生物的生长，还可以促进寄主的生长。因此，越来越受到植物病理学家的重视。目前国内外已有从不同植物中获得内生菌的报道，但杨树内生菌尚未见报道。我们尝试从杨树上获得内生细菌，为用于杨树病害的生物防治奠定基础。杨树水泡溃疡病（ Botryosphaeria dothidea）害标本由本实验室保存。分离材料取自山东省泰安市区和市郊绿化或用材杨树，将带杨树水泡溃疡病病斑的组织用常规稀释方法[1]，分离内生细菌。对分离得到的内生细菌进行划线培养，挑取单菌落纯化保存。将分离获得内生菌PE0704进行菌落形态观察、革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色[2]，并对PE0704的16SrDNA序列进行扩增、测序和序列分析。取PE0704菌体，以对峙培养法测定其对杨树水泡溃疡病菌菌丝生长的抑制作用，采用凹穴法测定其对病原菌孢子萌发的抑制作用。设置不同的发酵条件，对PE0704进行发酵培养，测定发酵液对杨树水泡溃疡病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用。不同的分离方法对杨树内生细菌的分离效果不同。尤其是组织块的破碎程度以及经消毒、破碎后的组织块是否振荡处理，对内生细菌的分离影响很大。改进的分离方法如下：首先将组织块用75%的酒精、5%的NaClO进行表面消毒，研碎，然后在25℃下振荡培养2h，取培养液，按常规稀释法稀释、涂板，置28℃下培养。利用该方法，从杨树中获得37个内生细菌菌株。经初步筛选得到了对杨树水泡溃疡病菌抑菌活性较好的内生细菌菌株，其中菌株PE0704抑菌效果表现最好。将PE0704在NB平板培养基上划线培养，培养24h时菌落表现为白色、椭圆形、边缘整齐、中央凹陷、表面干燥、粗糙、不透明。该菌体短棒形，两端钝圆，产芽孢、中生、周生鞭毛、革兰氏染色为阳性。对PE0704的16SrDNA进行扩增、测序，共获得该菌16SrDNA的全长为1500bp的部分序列，该序列通过NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST比对，与已报道的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的16SrDNA序列相似度高，其中与枯草芽孢杆菌（B.subtilis）（AB016721.1）等的相似度高达97%以上。结合该菌的菌体形态和染色反应结果，参照《常见细菌系统手册》（第1版）[3]，基本确定该菌株为B.subtilis。PE0704的菌体对杨树水泡溃疡病菌的菌丝生长有较强的抑制作用，能够明显抑制菌落生长直径，并导致菌丝形态发生了显著变化。镜检发现，其菌丝细胞粗短，扭曲；菌丝顶端和中部细胞膨大成球形或椭圆形；随着时间的延长畸变程度加重，菌丝出现断裂、变成空泡。PE0704的菌体能够抑制杨树水泡溃疡病病菌的孢子萌发，并引起萌发孢子的芽管畸变、其菌丝畸形。对PE0704进行不同条件的发酵培养，结果发现，PE0704的发酵液能够抑制杨树水泡溃疡病菌的菌丝生长和孢子萌发，并引起菌丝形态异常。在几种供试培养基中，在BPY中培养获得的发酵液的抑制作用最强，振荡培养72h的发酵液开始表现明显抑菌作用，96h的抑菌作用最强。杨树中存在着对杨树水泡溃疡病菌具有抑制作用的内生细菌，本试验从杨树中获得了37个内生细菌菌株，部分具有抑菌活性。通过菌落形态观察，革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色，并经16SrDNA序列分析，确定获得的内生菌株PE0704为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。PE0704菌的菌体和发酵滤液对杨树水泡溃疡病菌菌丝生长和孢子萌发都有较好的抑制效果，能够抑制其菌落生长，并引起菌丝形态产生畸形，能够抑制病原菌孢子萌发，并引起其芽管畸形。鉴于PE0704对杨树水泡溃疡病菌的良好作用效果，可进一步开展菌株拮抗作用机理和发酵条件的研究，为生物农药的研发提供重要依据。

目前的机制解析工作集中在对QS转录调控的研究。利用pcoI：：lacZ的染色体融合报告菌株，通过转座子Tn5随机插入突变，获得了一系列QS系统的上游调控因子。GacS/GacA双因子调控系统正调控QS系统的表达，同时正调控抗生素2，4-DAPG、氢氰酸和蛋白酶等的产生。该系统位于生防相关性状表达的信号传递链上游（图1），对生防功能起到重要的调控作用。通过转座子随机突变，还得到rpoS基因等一系列QS系统的负调控基因，其调控机制及与生防能力的关系正在研究中。图1 Pseudomonas fluorescens 2P24中与生防性状相关调控因子作用模式图